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目的:肺纤维化是一种进行性且致命性的呼吸系统疾病。除肺移植外,目前仍缺乏令人满意的方法。药物治疗中的吡非尼酮和尼达尼布仅能延缓患者用力肺活量（Forced vital capacity,FVC）下降速率,在一定程度上能够降低死病死率,但副作用较多且价格昂贵。临床观察发现,麦味养肺汤（Maiwei Yangfeidecoction,MWYF）能够改善肺纤维化患者的临床症状、提高生活质量,且具有良好的安全性。前期基础研究发现MWYF具有抗肺纤维化作用,但其分子机制仍不明确。本研究拟完成MWYF水煎液化学成分分析,明确其对肺纤维化小鼠治疗作用,并深入探讨MWYF是否通过p53抑制肺成纤维细胞衰老发挥抗肺纤维化的作用机制。方法:1.MWYF的成分分析:MWYF饮片经过三次纯水煎煮,经过滤和浓缩获得一定浓度水煎液;制备样品与标准品,通过超高效液相色谱-线性离子阱-静电轨道阱联用质谱（UPLC/LTQ-Orbitrap-MS）技术进行检测,获得总离子流图（正负离子）、保留时间、相对分子质量、峰强度等信息,通过与标准品比对完成MWYF定性分析。2.MWYF对肺纤维化小鼠的改善作用:将72只小鼠分为空白组、模型组、MWYF低剂量组（20g/kg/d）、MWYF 中剂量组（40g/kg/d）、MWYF 高剂量组（60g/kg/d）和吡非尼酮组（0.3g/kg/d）,每组12只。利用气溶胶气管内定量给药器滴注博来霉素（Bleomycin,BLM）诱导肺纤维化小鼠模型,并分别给予上述不同浓度的MWYF和吡非尼酮连续灌胃21天。通过组织病理学染色、肺功能检测、胸部Micro CT检测、免疫组化和ELISA检测等来评估小鼠肺纤维化改善程度。3.MWYF 的网络药理学研究:利用 TCMSP、TCMID、SEA 和 SwissTargetPrediction 数据库检索MWYF中12味中药的全部活性成分及靶点,合并且去除重复后作为MWYF的潜在治疗靶点。通过OMIM、GeneCards Suite、CTD和TTD数据库检索肺纤维化疾病相关的靶点,合并且去除重复后作为肺纤维化的潜在靶点。将两者共同靶点通过STRING平台制作PPI图,并进行拓扑学分析,选出核心靶点。借助DAVID生物信息数据库进行GO和KEGG富集分析。4.MWYF的转录组学研究:于空白组、模型组和MWYF高剂量组中各取三只小鼠新鲜肺组织用于转录组学测序。获得高质量测序数据后使用联川生物云平台进行样本相关性分析、差异基因表达分析和信号通路富集分析,快速确定候选基因与发现潜在作用机制。最后,通过RT-PCR方法对差异基因聚类热图结果中的部分基因进行验证。5.MWYF在体内和体外抑制肺成纤维细胞衰老的研究:①体内:通过衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal）染色观察小鼠肺组织衰老情况,利用Western Blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16在小鼠肺组织中的表达情况,通过免疫荧光观察肺组织中成纤维细胞标志物α-SMA与衰老相关蛋白p53、p21和p16的共染情况。②体外:提取小鼠原代肺成纤维细胞,利用免疫组化对提取的成纤维细胞进行鉴定,通过CCK-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）确定MWYF冻干粉给药剂量。将原代肺成纤维细胞分为空白组,模型组,MWYF低剂量组（400μg/mL）,MWYF中剂量组（600 μg/mL）和MWYF高剂量组（800 μg/mL）。利用阿霉素（Doxorubicin,DOX）干预48 h建立细胞衰老模型,分别用含不同浓度MWYF冻干粉的培养基干预24h,通过SA-β-Gal染色观察肺成纤维细胞衰老情况,利用Western Blot检测衰老相关蛋白p53、p21、p16和衰老相关分泌因子（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）在肺成纤维细胞中的表达情况。6.MWYF通过p53抑制肺成纤维细胞衰老的研究:通过构建过表达和沉默的p53质粒,并对肺成纤维细胞的p53基因分别进行过表达和沉默。确定质粒构建成功并排除质粒本身对细胞的影响后,通过SA-β-Gal染色观察肺成纤维细胞衰老情况,利用Western Blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16在肺成纤维细胞中的表达情况。结果:1.MWYF的成分分析:通过UPLC/LTQ-Orbitrap-MS的定性分析,共鉴定出9种物质,即正离子模式下:盐酸麻黄碱、甘草苷、五味子醇甲;负离子模式下:阿魏酸、橙皮苷、党参炔苷、迷迭香酸、黄芩苷、甘草酸。2.MWYF对肺纤维化小鼠的改善作用:MWYF可以增加小鼠体重,减少小鼠呼吸阻力和增强呼吸顺应性,减轻小鼠肺部炎症和纤维化程度,降低小鼠肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、PYD和HYP的表达。其中以MWYF高剂量组和吡非尼酮组效果最为明显。3.MWYF的网络药理学研究:数据库分析获得MWYF中260个潜在靶点,肺纤维化中1657个相关靶点。合并且去除重复后获得124个公共靶点。利用STRING平台,最终筛选出19个核心靶点。KEGG富集分析发现p53信号通路差异较大,可能是潜在作用机制之一。4.MWYF的转录组学研究:Pearson相关系数和主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）结果发现三个组的组内差异较小,分布相对集中,表明差异表达基因更具可靠性。差异基因分析发现,与正常组相比,模型组上调957个基因,下调876个基因。与模型组相比,MWYF高剂量组上调690个基因,下调1043个基因。KEGG富集分析发现,p53信号通路显著性较高。通过对p53信号通路中的差异表达基因做层次聚类分析,发现MWYF能够回调 Trp53（p53）、Cdk1、Cdkn1a（p21）、Cdkn2a（p16）、Ccnb1、Ccnd2 等细胞周期基因表达水平。最后,我们选取聚类结果中差异表达较为明显的p53、p21、Cdk1与Ccnd2基因,通过RT-PCR从基因层面验证其表达量相关性,发现与转录组学测序结果保持一致。5.MWYF在体内和体外抑制肺成纤维细胞衰老的研究:在小鼠体内,发现MWYF能够降低肺组织中SA-β-Gal活性,减少衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达水平,同时通过双荧光标记发现MWYF可以减少小鼠肺组织中肺成纤维细胞衰老。在体外,发现MWYF能够降低肺成纤维细胞中SA-β-Gal活性,减少衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达水平,抑制SASP表达。体内和体外结果均显示MWYF高剂量组冻干粉效果最为明显。6.MWYF通过p53抑制肺成纤维细胞衰老的研究:通过质粒载体对肺成纤维细胞实现p53基因沉默后发现,MWYF减少肺成纤维细胞衰老作用受到抑制,降低p21和p16蛋白表达能力受到抑制;通过质粒载体对肺成纤维细胞实现p53基因过表达后发现,MWYF减少肺成纤维细胞衰老作用未受抑制,降低p21和p16蛋白表达能力也未受到抑制。结论:1.MWYF能够通过改善小鼠肺功能,减轻肺部炎症和减少肺组织胶原沉积发挥抗肺纤维化作用。2.MWYF在小鼠体内和体外均可抑制肺成纤维细胞衰老从而发挥抗肺纤维化作用。3.MWYF可以通过p53信号通路抑制肺成纤维细胞衰老发挥抗肺纤维化作用。