根瘤菌氨基酸转运系统noc及鞭毛结构基因flgE生理功能的研究

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根瘤菌是一种革兰氏阴性细菌,它能与豆科植物共生形成根瘤,固定大气中的N2,为植物的生长提供必需的氮源。在根瘤菌体内存在多种调控根瘤菌与宿主间互作的途径,如细菌对营养物质的趋化性、细菌的游动性及群体感应等。本论文针对根瘤菌在共生过程中涉及的对营养物质响应及其运动性,主要研究了菜豆根瘤菌氨基酸转运系统noc基因簇的生理功能,以及天山根瘤菌中编码鞭毛钩形鞘蛋白的flgE基因在其与宿主互作早期阶段所发挥的生理功能。  根瘤菌与根癌农杆菌是普遍存在于植物根际的革兰氏阴性细菌,属于根瘤菌科。在自然条件下它们都能趋向性地感染双子叶植物的根部,致使植物形成瘤状体,但根瘤菌仅限于豆科植物。根癌农杆菌在侵染植物后能诱导植物分泌一种氨基酸和糖类的衍生物—冠瘿碱。根癌农杆菌的基因组上存在一套转运和代谢冠瘿碱及其结构类似物的基因簇,使根癌农杆菌能够在植物体内以冠瘿碱为碳源和氮源进行生长,成功在宿主体内定殖。本研究将根癌农杆菌中与冠瘿碱代谢相关的基因与菜豆根瘤菌的基因组进行了在线比对分析发现,菜豆根瘤菌CFN42基因组上存在一个noc基因簇,该基因簇包含nocR、nocQ、nocM及nocT四个基因,其中nocR编码氨基酸转运渗透酶的调控蛋白,nocQ与nocM编码氨基酸转运渗透酶,nocT编码一个假设蛋白。通过构建翻译融合质粒pRA302-nocQM∷lacZ,分别检测nocQ在菜豆根瘤菌野生型菌株与△nocR菌株中的表达,结果显示nocQ在△nocR中的表达量是其在野生型菌株中表达量的5倍,表明nocR对于nocQM的表达存在抑制作用。通过框内敲除的方法得到基因缺失突变菌株△nocR与△nocQM,检测了野生型菌株和突变株在基本盐培养基M1中以不同氨基酸作为唯一氮源、碳源和碳氮源时的生长情况,发现当以脯氨酸为唯一氮源或者以谷氨酸为唯一碳氮源时,与野生型菌株相比,△nocR菌株表现出明显的生长优势,△nocQM菌株的生长与野生型菌株生长一致;而以鸟氨酸为唯一氮源时,△nocR菌株表现出明显的生长抑制现象,△nocQM菌株的生长与野生型菌株生长一致。结果表明,在体外条件下菜豆根瘤菌的noc氨基酸代谢系统与脯氨酸、鸟氨酸及谷氨酸的转运代谢相关,并且NocR还调控其它与这些氨基酸代谢相关的基因。此外,本研究通过根毛吸附实验和结瘤实验,对菜豆根瘤菌noc系统的生理功能进行了研究。结果显示,野生型菜豆根瘤菌与△nocQM菌株在根毛吸附能力上差异不显著,△nocR菌株的根毛吸附能力较野生型菌株增强了2倍,野生型菌株在结瘤能力上显著高于△nocR和△nocQM菌株,且△nocR菌株的结瘤能力显著强于△nocQM菌株。比较每个植株上形成根瘤的总重发现,野生型菌株的根瘤重显著高于△nocQM,略高于△nocR突变株;△nocR突变株形成的根瘤总重显著高于△nocQM。该结果表明noc基因簇对菜豆根瘤菌结瘤能力存在一定的影响,并且该基因簇在菜豆根瘤菌与宿主植物互作过程中发挥生物学功能。  目前关于根瘤菌鞭毛钩蛋白与共生固氮关系的报道较少。为了研究天山根瘤菌中编码鞭毛钩形鞘蛋白的基因在鞭毛合成中的生物学功能,本研究通过分析该氨基酸的结构域,发现flgE编码的钩状蛋白在第一区域具有高度的保守性,第二区域的保守性则相对较低,对该菌株中编码鞭毛钧蛋白的flgE基因进行PCR扩增,获得该基因的全长片段。对该基因进行表达分析,发现在根瘤菌生长前期flgE基因的转录水平随着细菌细胞密度的增加而增加,直至对数中期其表达量达到最大值。flgE基因的缺失或突变会导致天山根瘤菌丧失鞭毛合成能力,使其失去游动性,改变其趋化性及生物膜的形成能力。此外,天山根瘤菌的鞭毛缺失还会使其对宿主植物甘草根毛的粘附能力下降,表明鞭毛在天山根瘤菌与豆科植物形成共生关系的早期过程中发挥重要的作用。  本论文通过研究根瘤菌中氨基酸代谢系统及鞭毛复合体中结构蛋白在根瘤菌共生固氮过程中的生理功能,发现根瘤菌对环境中营养物质的响应及与之相关的趋化性对根瘤菌的共生固氮能力具有显著地影响。
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