反复种植失败（repeated implantation failure,RIF）是指经历3次以上胚胎移植或累计移植4～6枚优质卵裂期胚胎或3枚以上优质囊胚均失败,给患者及家庭造成巨大的精神压力和经济负担。RIF的病因与机理是当前生殖领域研究的热点与难点。既往研究认为胚胎非整倍体是导致RIF的重要原因,应用胚胎植入前非整倍体遗传学检测（pre-implantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A）技术选择整倍体胚胎可提高种植率。此外,影响胚胎种植的另一关键因素是种植窗期子宫内膜容受性（endometrial receptivity,ER）。近年来,随着人们对胚胎-子宫内膜交叉对话和胚胎植入机制的探究,子宫内膜基因的差异表达与调控受到广泛关注,但相关研究仍处于初始阶段。转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）技术可快速并全面获取该状态特定组织的转录本,包括信使RNA（messenger RNA,mRNA）和非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）作为一种近期发现的基因表达调控模式,是mRNA和ncRNA等转录物通过微小RNA（microRNA,miRNA）应答元件竞争性结合相同的miRNA来调控各自的表达水平,从而影响细胞的功能,为研究疾病的机制提供了新的线索。本研究首先观察RIF患者应用PGT-A技术能否改善其妊娠结局。继而以RIF患者和正常生育女性为研究对象,评估RIF患者子宫内膜容受性。基于RNA-seq技术,对其种植窗期子宫内膜进行RNA测序,筛选影响子宫内膜容受性的候选基因,通过生物信息学分析构建ceRNA调控网络,最终体外细胞实验验证ceRNA的靶向调控。为阐明RIF病因及机理奠定理论基础,为改善RIF患者妊娠结局提供潜在的干预靶点。第一部分 反复种植失败患者应用PGT-A对妊娠结局的影响目的本研究拟在RIF患者中比较基于高通量测序（next-generation sequencing,NGS）的PGT-A技术和仅通过形态学评分选择的囊胚进行首次冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer,FET）周期的妊娠结局,以期探讨PGT-A在RIF患者中的临床应用价值。方法回顾性分析2017年1月～2019年12月于我院就诊的RIF患者临床资料,选取基于NGS技术PGT-A助孕的RIF患者29例作为PGT-A组,另选取同期行体外受精（in vitro fertilization,IVF）助孕的RIF患者108例作为对照组,两组患者全胚冷冻后选择1枚形态学评分最优的囊胚进行首次FET周期,比较两组妊娠结局。结果1.PGT-A组与对照组的平均年龄、体重指数（body mass index,BMI）、窦卵泡数（antral follicle count,AFC）、抗苗勒氏管激素（anti-Müllerian hormone,AMH）、基础促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、不孕类型等数据进行比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.PGT-A组共活检120枚囊胚,其中52.14%为整倍体囊胚,27.35%为非整倍体囊胚,20.51%为嵌合体囊胚。优质囊胚组的整倍体率显著高于中等质量囊胚组（78.95%vs.41.67%,P=0.011）和低质量囊胚组（78.95%vs.50%,P=0.034）,差异均有统计学意义。拟合曲线结果显示＜38岁的PGT-A患者胚胎整倍体率随年龄增加无明显下降趋势（P=0.149）。3.PGT-A组与对照组移植优质囊胚比例（55.17%vs.44.44%）、内膜准备方案等冻胚移植周期数据比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。4.PGT-A组与对照组的临床妊娠率（72.41%vs.52.78%）、自然流产率（19.05%vs.22.81%）和活产率（58.62%vs.40.74%）比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论反复种植失败患者应用PGT-A技术未显著改善妊娠结局。第二部分基于RNA-seq分析筛选子宫内膜容受性关键基因目的本研究拟采用超声参数评估RIF患者子宫内膜容受性,筛选并鉴定影响容受性的关键基因,为后续研究其调控网路与RIF的发病机制做出铺垫。方法选取2017年1月～2019年12月行PGT-A助孕失败的RIF患者15例作为RIF组,另选取同期正常生育女性15例作为对照组。1.采用化学发光法检测种植窗期血清雌二醇（estradiol,E2）和孕酮（progesterone,P）水平。2.应用阴道三维超声检查获得子宫内膜超声参数。3.用子宫内膜取样器行子宫内膜组织活检。并随机选取RIF组和对照组患者各3例,应用RNA-seq技术检测子宫内膜,筛选信使RNA（messenger RNA,mRNA）差异表达谱,对高通量测序结果进行生物信息学分析,对差异表达的基因进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）功能富集分析,筛选出与子宫内膜容受性相关的差异关键基因。通过定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）在15例RIF患者和15例对照组患者中进行独立扩大样本的验证。4.采用免疫组化染色观察可能影响子宫内膜血流的候选基因在两组患者子宫内膜的表达情况。结果1.RIF组和对照组胚胎种植窗期E2和P检测值均符合子宫内膜分泌期水平,差异无统计学意义（P＞0.05）。2.RIF组双侧子宫动脉S/D之和（11.28±2.59）明显高于对照组（9.06±2.22）,差异有统计学意义（P=0.018）;RIF组子宫内膜血流分布“佳”者占比（13.33%）显著低于对照组（66.67%）,差异有统计学意义（P=0.008）。3.比较RIF组与对照组种植窗期子宫内膜,共检测到820个差异表达的mRNA（上调338个,下调482个）,基因富集在缺氧诱导因子-1通路、神经活性配体受体相互作用、Hippo信号通路、细胞粘附分子等信号通路。通过GO富集和KEGG通路分析得到12个可能影响子宫内膜容受性的候选基因:SDC1、LGR4、IL15、TLR4、TIMP2、WNT4、GSTM5、MSX2、UPK3BL1、MMP11、ECM1和HOXA11。扩大样本对关键基因进行qPCR验证,结果显示与测序样本结果表达趋势一致。4.通过查阅文献,筛选出可能影响子宫内膜血流的基因SDC1。免疫组化结果显示RIF组多配体蛋白聚糖1（Syndecan1,SDC1）的表达显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。5.Pearson直线相关分析显示,RIF组子宫内膜组织中SDC1的表达与双侧子宫动脉S/D之和成正相关（r=0.859,P＜0.001）。结论反复种植失败患者子宫内膜容受性下降,其子宫内膜存在显著差异表达的mRNA,SDC1可能通过影响RIF患者子宫内膜血流导致容受性下降。第三部分构建子宫内膜ceRNA调控网络及其互作机制研究目的应用RNA-seq测序技术检测调控靶基因的ncRNA表达谱,构建RIF患者子宫内膜ceRNA调控网络,并在子宫内膜细胞系实验验证其靶向调控。为阐明RIF病因及机理奠定理论基础,为改善RIF患者妊娠结局提供潜在的干预靶点。方法1.同第二部分的测序标本,利用RNA-seq测序结果,筛选ncRNA包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）、环状RNA（circular RNA,circRNA）及miRNA差异表达谱,对高通量测序结果进行生物信息学分析,对差异表达的ncRNA的靶基因进行GO和KEGG功能富集分析。2.筛选出部分差异表达的ncRNA在15例RIF患者和15例对照组患者中进行qPCR验证。3.根据转录组测序结果,构建ceRNA调控网络。4.体外培养人子宫内膜上皮细胞系（human endometrial epithelium cells,hEECs）,应用基因沉默及过表达技术,采用qPCR及蛋白印迹（Western blot）实验验证circRNA-miRNA-mRNA之间的调控关系。5.通过双荧光素酶系统,对调控网络中circ1621与miR210-5p,以及miR-210-5p与SDC1的靶向关系进行进一步的验证。结果1.对比RIF组和对照组,共检测到36个差异表达的miRNA（上调25个,下调11个）,1542个差异表达的;ncRNA（上调702个,下调840个）和131个差异表达的circRNA（上调75个,下调56个）。靶基因多富集在细胞代谢、蛋白激酶活性和细胞内转运调控等相关生物过程中,主要参与Rap1信号通路、Ras信号通路、粘附和胞饮等信号通路。2.通过对差异表达的ncRNA进行扩大样本的qPCR验证,结果显示与测序结果表达趋势一致。3.ceRNA调控网络分析结果显示,miR-210-5p是中枢调控因子,预测其靶基因SDC1。circ1621可作为“海绵”吸收miR-210-5p,参与调节SDC1的转录或表达。4.qPCR和Western Blot结果显示,hEECs过表达circ1621显著降低了miR-210-5p的表达,沉默circ1621其表达显著升高。同时,hEECs转染miR-210-5p模拟物（mimics）后可显著抑制SDC1转录及蛋白表达,miR-210-5p抑制物（inhibitor）转染hEECs后SDC1的转录水平和蛋白表达水平均显著升高。5.双荧光素酶实验显示,miR-210-5p可与circ1621和SDC1 3’UTR区域的靶位点序列结合。hEEC细胞过表达miR-210-5p显著降低了circ1621和SDC1 3’UTR双荧光素酶系统中萤火虫荧光素酶的活性。结论circ1621作为miR-210-5p海绵吸附体间接调控子宫内膜上皮细胞SDC1的转录或表达,从而构成ceRNA调控网络影响子宫内膜容受性,参与RIF的发病机制。