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研究背景：
近年来，辅助生殖技术的进步和实验室培养条件的提升使得单个周期移植成功率得到了很大的提高，但是，反复种植失败(Recurrent implantation failure，RIF)依旧是普遍存在的难题和研究热点。关于RIF的定义，目前临床上较为公认的是在40岁以下的患者中，在至少3个新鲜或冷冻周期中移植至少4个优质胚胎后未能实现临床妊娠。RIF的病因有很多，包括影响配子/胚胎发育的因素;影响子宫内膜容受性的因素;以及其他免疫及代谢因素。成功妊娠依赖于优质的胚胎和良好的子宫内膜容受性，其中子宫内膜容受性下降是导致RIF的一个重要因素。子宫内膜容受性是胚胎种植成功的关键因素，导致子宫内膜容受性下降的主要因素有子宫纵隔、弓形子宫等先天性子宫异常及子宫内膜薄、子宫内膜炎、子宫内粘连、子宫肌瘤、子宫内膜息肉等后天性子宫异常;此外，粘附分子、细胞因子及基因等的异常表达、免疫因素、血栓形成倾向等也可以降低子宫内膜容受性。RIF因病因、机制不明缺乏有效治疗手段，是生殖医学领域亟待解决的难点。
通过提高RIF患者的子宫内膜容受性来提高妊娠率的方法已成为辅助生殖技术(Assisted reproductive technology，ART)领域的一个普遍但具有挑战性的目标。许多研究集中在如何提高子宫内膜的容受性，有研究报道，通过子宫内膜活检损伤子宫内膜，在随后的治疗周期中会提高妊娠率。现如今关于子宫内膜机械性刺激对提高子宫内膜容受性的机制研究多集中在炎症反应和基因调控方面。据研究报道，子宫内膜机械性刺激可以通过释放炎症相关因子，如TNF-α、IL-15、GRO-α、MIP-1B、OPN等，或经过LNα4、MMP-1、ITGα-6等基因调控来改善子宫内膜容受性。子宫内膜机械性刺激促进胚胎着床并且提高妊娠率的这一作用，使其作为一种潜在的治疗方法被许多学者进行研究。
缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)是一种氧依赖性转录激活因子，由HIF-1α和HIF-1β亚基构成，在缺氧条件下，α亚基被稳定并与HIF-1β聚合成异二聚体。缺氧条件下HIF-1α的积累使它们能够激活许多血管生成基因的表达，从而启动血管生成过程。HIF-1α在哺乳动物中大量存在，并且作为一种转录因子可以在缺氧环境中发挥特异性作用。胚胎发育早期处于低氧条件中，在缺氧条件下，HIF-1α大量聚集调节细胞凋亡并通过上调血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)转录增加血管生成。胚胎植入是一个复杂的生理过程，涉及细胞增殖、细胞凋亡和血管生成，以及其他许多因素。而HIF-1α表达水平与血管生成、细胞凋亡、血管舒缩功能、肿瘤生长和转移密切相关。因此，我们提出，HIF-1α可能参与胚胎种植失败的发生，研究其在子宫内膜着床窗口期的表达情况将有助于探索胚胎种植失败的发生机制。此外，子宫内膜机械性刺激改善子宫内膜容受性的的机制尚不明确，对妊娠结局影响的报道不一，本研究从干预前后自身对照HIF-1α的表达、血管生成及细胞凋亡的变化和对干预后妊娠结局观察两个方面，来探讨子宫内膜机械性刺激对子宫内膜容受性的影响及可能的机制。
本文在综述中对反复种植失败的定义、发生的原因及治疗方法进行了较全面的回顾。为反复种植失败的诊断和治疗提供了依据;也能为揭示RIF发病机制提供重要的病理学信息。
第一部分:子宫内膜机械性刺激对反复种植失败患者子宫内膜容受性影响的机制研究
研究目的：
通过比较反复种植失败患者和正常生育患者着床窗口期子宫内膜中HIF-1α的表达、血管生成和细胞凋亡情况，探讨反复种植失败的原因;干预前后自身对比HIF-1α的表达、血管生成和细胞凋亡情况，探讨子宫内膜机械性刺激影响子宫内膜容受性的可能机制。
实验方法：
本研究由山东大学齐鲁医院伦理委员会审核批准。
1.实验分组
RIF组:三次新鲜和/或冷冻复苏移植高质量胚胎未能妊娠的患者20名;
对照组:第一次胚胎移植成功妊娠分娩的患者10名，拟再次行胚胎移植前按照患者知情同意并自愿的原则下采集子宫内膜标本。
2.子宫内膜机械性刺激和样本采集
所有受试者进行阴道超声检查和尿促黄体生成素检测以监测卵泡生长和确定排卵时间，在种植窗期即月经19-23天，使用一次性子宫内膜取样器进行子宫内膜机械性刺激和样本采集，每位受试者的手术均由同一位手术经验丰富的医生进行。将采集后的组织样本固定在4％多聚甲醛中，用于之后的免疫组织化学(Immunohistonchemistry，IHC)分析和细胞凋亡测定。
3.指标检测
(1)采用免疫组织化学染色方法检测HIF-1α在子宫内膜中的表达;为了研究HIF-1α在RIF中的潜在作用，通过免疫组化染色的方法测定HIF-1α在子宫内膜中的表达。相同组织制作三份切片进行重复免疫组化染色。使用Image-ProPlus软件(Media Cybernetics，USA)定量分析HIF-1α结果。
(2)采用免疫组织化学染色方法检测子宫内膜中CD34的表达;微血管密度(Microvascular density, MVD)是反映血管生成的定量指标，CD34在新生血管中表达，是血管内皮细胞的特异性标记。因此，使用CD34抗体对子宫内膜样本进行免疫组化染色用于微血管密度的测定。相同组织制作三份切片进行重复免疫组化染色。使用Image-ProPlus软件定量分析CD34结果，参照Weidner的MVD计数方法。
(3)采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色进行子宫内膜细胞凋亡的检测;用TUNEL检测试剂盒评估凋亡细胞核中的DNA片段化，操作步骤按照试剂盒说明进行。在400×显微镜下随机选择五个视野中TUNEL阳性细胞计数，从而检测子宫内膜细胞凋亡情况。
数据采用SPSS21统计学软件(IBM，USA)处理，计量资料以平均值±标准差表示。符合正态分布的数据组间比较采用两独立样本t检验，组内干预前后比较采用配对样本t检验;不符合正态分布的数使用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis检验进行统计学分析;相关性分析采用直线相关Pearson相关系数分析。p值＜0.05表示差异具有统计学意义。
实验结果：
1.HIF-1α在子宫内膜组织中的表达情况
对照组中，HIF-1α在子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞和腔上皮细胞中表达，并且间质细胞核中的HIF-1α表达高于腔上皮细胞核和腺上皮细胞核中的HIF-1α表达。在RIF患者中，HIF-1α表达主要见于腺上皮细胞。与对照组相比，RIF组子宫内膜组织中的HIF-1α表达低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。经过子宫内膜机械性刺激后，RIF组子宫内膜组织中HIF-1α的表达明显增加(P＜0.05)。
2.子宫内膜组织中的MWD计数情况
RIF组子宫内膜微血管密度(MVD)计数明显低于对照组(P＜0.05)。子宫内膜机械性刺激可以显著提高子宫内膜的血管新生(P＜0.05)。
3.子宫内膜细胞的凋亡
与对照组相比，RIF组子宫内膜细胞凋亡明显减少(P＜0.05)。子宫内膜机械性刺激对子宫内膜细胞的凋亡没有明显改变(P＞0.05)。
4.子宫内膜组织中HIF-1α表达和MVD计数的关系
RIF组子宫内膜组织中HIF-1α表达的积分光密度值为0.19±0.04，MVD计数为16.89±6.10，r=0.77，两者呈正相关(P＜0.05);子宫内膜机械性刺激后子宫内膜组织中HIF-1α表达的积分光密度值为0.27±0.06，MVD计数为25.90±8.76，，r=0.83，两者呈正相关(P＜0.05)。
第二部分:子宫内膜机械性刺激对反复种植失败患者冻融胚胎移植结局的影响
研究目的：
通过对治疗组和对照组胚胎移植后妊娠结局的比较，探讨子宫内膜机械性刺激对反复种植失败患者再次冻融胚胎移植结局的影响。
实验方法：
1.实验对象
2016年1月至2016年12月在山东大学齐鲁医院不孕不育诊疗中心行体外受精-胚胎移植治疗符合纳入标准的全部反复种植失败患者(至少三次新鲜和/或冷冻复苏移植高质量胚胎未能妊娠)81例，根据是否在冻融胚胎移植前进行子宫内膜机械性刺激分为治疗组(同第一部分20例患者)和对照组(61例患者)。
2.子宫内膜机械性刺激和胚胎移植
使用一次性子宫内膜取样器进行子宫内膜机械性刺激，每位受试者的手术均由同一位手术经验丰富的医生进行。治疗组20例患者连续在两个月经周期的种植窗期进行子宫内膜机械性刺激，并在第二次子宫内膜机械性刺激后的下一个月经周期进行自然周期冻融胚胎移植，每位患者移植1-2个D2或1个D5/D6胚胎。
3.观察指标
(1)基本资料:年龄、体重指数、胚胎移植失败周期次数、FSH、AMH、AFC、排卵日子宫内膜厚度(mm)、移植日子宫内膜厚度(mm)、移植胚胎数。
(2)临床指标:生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、分娩率。
统计分析数据采用SPSS21统计学软件(IBM，USA)处理，计量资料以平均值±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验;计量资料以率(％)表示，两组间率的比较采用x2检验;p值＜0.05表示差异具有统计学意义。
实验结果：
1.受试者基本情况
所有受试者的年龄、体重指数、胚胎移植失败周期次数、FSH、AMH、AFC、排卵日子宫内膜厚度(mm)、移植日子宫内膜厚度(mm)、移植胚胎数均无显著性差异。
2.子宫内膜机械性刺激对妊娠结局的影响
治疗组的生化妊娠率高于对照组(55.0％vs41.0％)，但无显著差异(P＞0.05);治疗组的临床妊娠率高于对照组(45.0％vs36.1％)，治疗组胚胎种植率高于对照组(38.2％vs29.4％)，治疗组的分娩率高于对照组(40％vs 31.1％)，但均没有统计学意义(P＞0.05);两组的自然流产率(11.1％vs1 3.6％)的差异不明显(P＞0.05)。
实验结论：
1、反复种植失败患者围着床期子宫内膜中HIF-1α的异常表达导致血管生成的减少参与了胚胎种植失败的发生。通过干预前后自身对照研究发现，子宫内膜机械性刺激通过提高子宫内膜组织中HIF-1α的表达促进子宫内膜的血管生成，提高子宫内膜容受性。
2、本组临床数据分析显示自然周期冻融胚胎移植前进行子宫内膜机械性刺激，与对照组相比尽管妊娠结局没有统计学意义，但生化妊娠率、胚胎种植率、临床妊娠率及分娩率等均有升高的趋势，提示子宫内膜机械性刺激可以促进胚胎着床。但本研究例数较少，需进一步进行大样本研究观察其对妊娠结局的影响。
3、本研究中使用的一次性子宫内膜取样器可同时完成子宫内膜机械性刺激及内膜取样，患者痛苦小，使用方便，易于标准化操作。
近年来，辅助生殖技术的进步和实验室培养条件的提升使得单个周期移植成功率得到了很大的提高，但是，反复种植失败(Recurrent implantation failure，RIF)依旧是普遍存在的难题和研究热点。关于RIF的定义，目前临床上较为公认的是在40岁以下的患者中，在至少3个新鲜或冷冻周期中移植至少4个优质胚胎后未能实现临床妊娠。RIF的病因有很多，包括影响配子/胚胎发育的因素;影响子宫内膜容受性的因素;以及其他免疫及代谢因素。成功妊娠依赖于优质的胚胎和良好的子宫内膜容受性，其中子宫内膜容受性下降是导致RIF的一个重要因素。子宫内膜容受性是胚胎种植成功的关键因素，导致子宫内膜容受性下降的主要因素有子宫纵隔、弓形子宫等先天性子宫异常及子宫内膜薄、子宫内膜炎、子宫内粘连、子宫肌瘤、子宫内膜息肉等后天性子宫异常;此外，粘附分子、细胞因子及基因等的异常表达、免疫因素、血栓形成倾向等也可以降低子宫内膜容受性。RIF因病因、机制不明缺乏有效治疗手段，是生殖医学领域亟待解决的难点。
通过提高RIF患者的子宫内膜容受性来提高妊娠率的方法已成为辅助生殖技术(Assisted reproductive technology，ART)领域的一个普遍但具有挑战性的目标。许多研究集中在如何提高子宫内膜的容受性，有研究报道，通过子宫内膜活检损伤子宫内膜，在随后的治疗周期中会提高妊娠率。现如今关于子宫内膜机械性刺激对提高子宫内膜容受性的机制研究多集中在炎症反应和基因调控方面。据研究报道，子宫内膜机械性刺激可以通过释放炎症相关因子，如TNF-α、IL-15、GRO-α、MIP-1B、OPN等，或经过LNα4、MMP-1、ITGα-6等基因调控来改善子宫内膜容受性。子宫内膜机械性刺激促进胚胎着床并且提高妊娠率的这一作用，使其作为一种潜在的治疗方法被许多学者进行研究。
缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)是一种氧依赖性转录激活因子，由HIF-1α和HIF-1β亚基构成，在缺氧条件下，α亚基被稳定并与HIF-1β聚合成异二聚体。缺氧条件下HIF-1α的积累使它们能够激活许多血管生成基因的表达，从而启动血管生成过程。HIF-1α在哺乳动物中大量存在，并且作为一种转录因子可以在缺氧环境中发挥特异性作用。胚胎发育早期处于低氧条件中，在缺氧条件下，HIF-1α大量聚集调节细胞凋亡并通过上调血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)转录增加血管生成。胚胎植入是一个复杂的生理过程，涉及细胞增殖、细胞凋亡和血管生成，以及其他许多因素。而HIF-1α表达水平与血管生成、细胞凋亡、血管舒缩功能、肿瘤生长和转移密切相关。因此，我们提出，HIF-1α可能参与胚胎种植失败的发生，研究其在子宫内膜着床窗口期的表达情况将有助于探索胚胎种植失败的发生机制。此外，子宫内膜机械性刺激改善子宫内膜容受性的的机制尚不明确，对妊娠结局影响的报道不一，本研究从干预前后自身对照HIF-1α的表达、血管生成及细胞凋亡的变化和对干预后妊娠结局观察两个方面，来探讨子宫内膜机械性刺激对子宫内膜容受性的影响及可能的机制。
本文在综述中对反复种植失败的定义、发生的原因及治疗方法进行了较全面的回顾。为反复种植失败的诊断和治疗提供了依据;也能为揭示RIF发病机制提供重要的病理学信息。
第一部分:子宫内膜机械性刺激对反复种植失败患者子宫内膜容受性影响的机制研究
研究目的：
通过比较反复种植失败患者和正常生育患者着床窗口期子宫内膜中HIF-1α的表达、血管生成和细胞凋亡情况，探讨反复种植失败的原因;干预前后自身对比HIF-1α的表达、血管生成和细胞凋亡情况，探讨子宫内膜机械性刺激影响子宫内膜容受性的可能机制。
实验方法：
本研究由山东大学齐鲁医院伦理委员会审核批准。
1.实验分组
RIF组:三次新鲜和/或冷冻复苏移植高质量胚胎未能妊娠的患者20名;
对照组:第一次胚胎移植成功妊娠分娩的患者10名，拟再次行胚胎移植前按照患者知情同意并自愿的原则下采集子宫内膜标本。
2.子宫内膜机械性刺激和样本采集
所有受试者进行阴道超声检查和尿促黄体生成素检测以监测卵泡生长和确定排卵时间，在种植窗期即月经19-23天，使用一次性子宫内膜取样器进行子宫内膜机械性刺激和样本采集，每位受试者的手术均由同一位手术经验丰富的医生进行。将采集后的组织样本固定在4％多聚甲醛中，用于之后的免疫组织化学(Immunohistonchemistry，IHC)分析和细胞凋亡测定。
3.指标检测
(1)采用免疫组织化学染色方法检测HIF-1α在子宫内膜中的表达;为了研究HIF-1α在RIF中的潜在作用，通过免疫组化染色的方法测定HIF-1α在子宫内膜中的表达。相同组织制作三份切片进行重复免疫组化染色。使用Image-ProPlus软件(Media Cybernetics，USA)定量分析HIF-1α结果。
(2)采用免疫组织化学染色方法检测子宫内膜中CD34的表达;微血管密度(Microvascular density, MVD)是反映血管生成的定量指标，CD34在新生血管中表达，是血管内皮细胞的特异性标记。因此，使用CD34抗体对子宫内膜样本进行免疫组化染色用于微血管密度的测定。相同组织制作三份切片进行重复免疫组化染色。使用Image-ProPlus软件定量分析CD34结果，参照Weidner的MVD计数方法。
(3)采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色进行子宫内膜细胞凋亡的检测;用TUNEL检测试剂盒评估凋亡细胞核中的DNA片段化，操作步骤按照试剂盒说明进行。在400×显微镜下随机选择五个视野中TUNEL阳性细胞计数，从而检测子宫内膜细胞凋亡情况。
数据采用SPSS21统计学软件(IBM，USA)处理，计量资料以平均值±标准差表示。符合正态分布的数据组间比较采用两独立样本t检验，组内干预前后比较采用配对样本t检验;不符合正态分布的数使用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis检验进行统计学分析;相关性分析采用直线相关Pearson相关系数分析。p值＜0.05表示差异具有统计学意义。
实验结果：
1.HIF-1α在子宫内膜组织中的表达情况
对照组中，HIF-1α在子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞和腔上皮细胞中表达，并且间质细胞核中的HIF-1α表达高于腔上皮细胞核和腺上皮细胞核中的HIF-1α表达。在RIF患者中，HIF-1α表达主要见于腺上皮细胞。与对照组相比，RIF组子宫内膜组织中的HIF-1α表达低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。经过子宫内膜机械性刺激后，RIF组子宫内膜组织中HIF-1α的表达明显增加(P＜0.05)。
2.子宫内膜组织中的MWD计数情况
RIF组子宫内膜微血管密度(MVD)计数明显低于对照组(P＜0.05)。子宫内膜机械性刺激可以显著提高子宫内膜的血管新生(P＜0.05)。
3.子宫内膜细胞的凋亡
与对照组相比，RIF组子宫内膜细胞凋亡明显减少(P＜0.05)。子宫内膜机械性刺激对子宫内膜细胞的凋亡没有明显改变(P＞0.05)。
4.子宫内膜组织中HIF-1α表达和MVD计数的关系
RIF组子宫内膜组织中HIF-1α表达的积分光密度值为0.19±0.04，MVD计数为16.89±6.10，r=0.77，两者呈正相关(P＜0.05);子宫内膜机械性刺激后子宫内膜组织中HIF-1α表达的积分光密度值为0.27±0.06，MVD计数为25.90±8.76，，r=0.83，两者呈正相关(P＜0.05)。
第二部分:子宫内膜机械性刺激对反复种植失败患者冻融胚胎移植结局的影响
研究目的：
通过对治疗组和对照组胚胎移植后妊娠结局的比较，探讨子宫内膜机械性刺激对反复种植失败患者再次冻融胚胎移植结局的影响。
实验方法：
1.实验对象
2016年1月至2016年12月在山东大学齐鲁医院不孕不育诊疗中心行体外受精-胚胎移植治疗符合纳入标准的全部反复种植失败患者(至少三次新鲜和/或冷冻复苏移植高质量胚胎未能妊娠)81例，根据是否在冻融胚胎移植前进行子宫内膜机械性刺激分为治疗组(同第一部分20例患者)和对照组(61例患者)。
2.子宫内膜机械性刺激和胚胎移植
使用一次性子宫内膜取样器进行子宫内膜机械性刺激，每位受试者的手术均由同一位手术经验丰富的医生进行。治疗组20例患者连续在两个月经周期的种植窗期进行子宫内膜机械性刺激，并在第二次子宫内膜机械性刺激后的下一个月经周期进行自然周期冻融胚胎移植，每位患者移植1-2个D2或1个D5/D6胚胎。
3.观察指标
(1)基本资料:年龄、体重指数、胚胎移植失败周期次数、FSH、AMH、AFC、排卵日子宫内膜厚度(mm)、移植日子宫内膜厚度(mm)、移植胚胎数。
(2)临床指标:生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、分娩率。
统计分析数据采用SPSS21统计学软件(IBM，USA)处理，计量资料以平均值±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验;计量资料以率(％)表示，两组间率的比较采用x2检验;p值＜0.05表示差异具有统计学意义。
实验结果：
1.受试者基本情况
所有受试者的年龄、体重指数、胚胎移植失败周期次数、FSH、AMH、AFC、排卵日子宫内膜厚度(mm)、移植日子宫内膜厚度(mm)、移植胚胎数均无显著性差异。
2.子宫内膜机械性刺激对妊娠结局的影响
治疗组的生化妊娠率高于对照组(55.0％vs41.0％)，但无显著差异(P＞0.05);治疗组的临床妊娠率高于对照组(45.0％vs36.1％)，治疗组胚胎种植率高于对照组(38.2％vs29.4％)，治疗组的分娩率高于对照组(40％vs 31.1％)，但均没有统计学意义(P＞0.05);两组的自然流产率(11.1％vs1 3.6％)的差异不明显(P＞0.05)。
实验结论：
1、反复种植失败患者围着床期子宫内膜中HIF-1α的异常表达导致血管生成的减少参与了胚胎种植失败的发生。通过干预前后自身对照研究发现，子宫内膜机械性刺激通过提高子宫内膜组织中HIF-1α的表达促进子宫内膜的血管生成，提高子宫内膜容受性。
2、本组临床数据分析显示自然周期冻融胚胎移植前进行子宫内膜机械性刺激，与对照组相比尽管妊娠结局没有统计学意义，但生化妊娠率、胚胎种植率、临床妊娠率及分娩率等均有升高的趋势，提示子宫内膜机械性刺激可以促进胚胎着床。但本研究例数较少，需进一步进行大样本研究观察其对妊娠结局的影响。
3、本研究中使用的一次性子宫内膜取样器可同时完成子宫内膜机械性刺激及内膜取样，患者痛苦小，使用方便，易于标准化操作。