论文部分内容阅读
哺乳动物的卵母细胞在个体出生前后,就进入第一次减数分裂,并被阻滞在第一次减数分裂前期的双线期,这种阻滞可能长达数月、数年甚至数十年之久,直到在排卵前促黄体素（LH）峰的刺激下,成熟卵泡中的卵母细胞才会恢复并完成减数分裂,成为具备受精和后续发育能力的成熟卵母细胞。在雌性哺乳动物的每个发情周期中,雌激素分泌波总是伴随着LH峰的出现,并在雌激素分泌波和LH峰出现之后发生成熟卵母细胞的排卵。而关于雌激素分泌波和LH峰调控卵母细胞减数分裂的具体机制及其二者之间的调控关系尚不十分明确。雌激素通过激活其核受体（ERs）和其膜受体（GPR30）,进而通过受体发挥不同的生物学效应。不同的雌激素受体与雌激素的亲和力不同,ERs与雌激素的亲和力较高,较低浓度雌激素即可激活ERs;而GPR30与雌激素亲和力较低,激活GPR30需要更高的雌激素浓度。本论文作者所在研究团队的前期研究显示,低浓度雌激素能够通过激活ERs信号通路增强CNP维持卵母细胞减数分裂的作用,而高浓度雌激素却能通过激活GPR30信号通路促进减数分裂恢复。因此,本研究主要聚焦于排卵前雌激素分泌波和LH峰调控卵丘-卵母细胞复合体卵丘细胞扩展的具体机制及雌激素分泌波与LH峰之间的调控关系。主要研究内容及其取得的研究结果如下:（1）LH信号提高了卵丘-卵母细胞复合体中的GPR30蛋白水平以小鼠和山羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）为研究对象,利用RT-q PCR、Western blot和免疫荧光技术检测了小鼠和山羊COCs在接收到LH/EGF（表皮生长因子）或EGF-like factors（类表皮样生长因子）信号刺激后GPR30的m RNA和蛋白水平变化,利用EGF受体（EGFR）抑制剂验证了LH/EGF（或EGF-like factors）调控GPR30表达的信号通路,并分别分析了卵丘细胞和卵母细胞中GPR30蛋白水平的变化情况。结果显示,LH和EGF或EGF-like factors长因子通过激活卵丘细胞上的EGFR信号通路,通过非基因组调控途径上调了卵丘细胞中的GPR30蛋白水平,但没有引起卵母细胞中GPR30蛋白水平的变化。（2）LH信号通过激活EGFR信号通路抑制颗粒细胞中GPR30蛋白的降解以小鼠卵泡颗粒细胞为研究对象,利用RT-q PCR、Western blot、溶酶体探针和免疫荧光技术检测了EGFR信号通路激活后GPR30蛋白半衰期的变化,利用蛋白酶体活性抑制剂MG132和溶酶体活性抑制剂bafilomycin A1探索了颗粒细胞中GPR30蛋白的降解途径,并对颗粒细胞内溶酶体进行细胞定位并检测其活力。结果显示,在颗粒细胞内GPR30蛋白主要通过自噬-溶酶体途径降解,在EGFR信号通路激活时通过非基因组调控途径降低了溶酶体的数量与活性,使GPR30降解受阻、半衰期延长,最终导致GPR30蛋白在细胞中累积。（3）雌激素通过激活GPR30信号通路提高卵丘细胞中的EGFR蛋白水平利用Western blot技术分别检测了体内成熟的小鼠COCs和山羊卵泡内的COCs中EGFR的蛋白水平,并将其变化趋势与体外培养的COCs进行比较;使用17β-雌二醇（17β-E2）、GPR30特异性激活剂G1、GPR30特异性抑制剂G15和雌激素核受体抑制剂ICI 182780处理体外培养的COCs,检测各处理组COCs中EGFR蛋白水平变化规律。结果发现,小鼠体内发育的COCs和体外培养山羊卵泡中的COCs,在成熟发育过程中EGFR蛋白水平升高,并维持在较高水平的激活状态;而体外培养的小鼠和山羊COCs,在成熟过程中EGFR蛋白水平降低,而且活化水平较低,激活后的维持时间也较短。在体外成熟培养液中加入17β-E2或G1能够提高EGFR蛋白水平,并发现G15能逆转17β-E2的作用,而ICI 182780则不能逆转17β-E2的作用。这些研究结果说明,雌激素能通过激活GPR30信号通路提高卵丘细胞中的EGFR蛋白水平。（4）雌激素-GPR30信号通路增强COCs对EGF的响应能力促进卵丘扩展分别使用添加17β-E2、G1、EGF、EGF+17β-E2、EGF+G1、EGF+17β-E2+G15和EGF+17β-E2+ICI 182780的培养液对小鼠和山羊COCs进行体外成熟培养,统计成熟后COCs的卵丘扩展指数和处于不同扩展等级的COCs比例;对各处理组小鼠和山羊卵丘扩展相关基因的表达水平进行检测,探讨雌激素促进卵丘扩展的作用及机制。结果显示,在EGF存在的情况下,17β-E2和G1能显著促进COCs的卵丘扩展,并提高扩展相关基因的表达水平;G15能逆转17β-E2的作用,而ICI 182780则不能逆转17β-E2促进卵丘扩展的作用。在无EGF的情况下,17β-E2和G1均无法单独促进卵丘扩展的发生。提示17β-E2无法直接促进卵丘扩展,但能通过激活GPR30信号通路提高COCs对EGF信号的响应能力,进而发挥促进卵丘扩展的作用。以上研究结果证明,卵母细胞成熟过程中LH和雌激素协同促进卵丘扩展。LH信号通过激活EGFR信号通路,抑制了卵丘细胞中的溶酶体途径,导致GPR30蛋白在细胞中累积;同时雌激素通过激活GPR30信号通路上调了卵丘细胞中EGFR的蛋白水平,从而通过提高COCs对EGF信号的响应能力,进而发挥促进卵丘扩展的作用。研究工作拓展了人们对哺乳动物卵母细胞成熟机制的认知,为进一步改良卵母细胞体外成熟培养体系、助推相关动物胚胎工程技术的研究与应用提供了理论基础。