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第1章引言肿瘤微环境中存在多种因素可导致免疫不应答或免疫低下,造成肿瘤免疫耐受。造成肿瘤免疫耐受原因有免疫负调控分子的改变,以调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)为代表的免疫抑制细胞的变化,可溶性细胞因子分泌改变,代谢功能异常等。耗竭性T细胞是一种T细胞功能缺陷的状态,是一群效应功能减弱,持续表达抑制性受体的T细胞,这些细胞在免疫耐受中起着重要作用。其表达的程序性细胞死亡因子-1(programmed cell death-1,PD-1)、T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域蛋白-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein 3,TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减子(B and T-lymphocte attenuator,BTLA)是最重要的免疫负调控分子。PD-1/程序性死亡因子配体-1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)信号通路可以负性调节效应T细胞活性,与肿瘤免疫耐受及肿瘤进展有关。micro RNA(mi RNA)参与肿瘤的发生发展过程,在染色体异常、基因突变、基因多态性和表观遗传学改变等过程中发挥重要作用。本课题系统探讨mi RNA和肿瘤微环境中耗竭性T细胞的关系,为肿瘤诊断及肿瘤免疫治疗寻找新的靶点和方向。第2章CD4+T细胞中PD-1+和PD-1-细胞mi RNAs表达谱差异目的:比较CD4+T细胞中PD-1+和PD-1-细胞mi RNAs表达谱差异,筛选PD-1相关mi RNA。方法:建立小鼠黑色素瘤模型,分离荷瘤小鼠淋巴细胞,流式细胞仪分选CD4+PD-1+和CD4+PD-1-T淋巴细胞,Affymetrix mi RNA 3.0表达谱芯片检测各组细胞mi RNA表达,并用RT-q PCR验证。mi Randa软件预测靶基因结合位点。双荧光素酶报告基因测试系统检测mi RNA能否结合PD-1 3’UTR。结果:CD4+PD-1+和CD4+PD-1-T淋巴细胞中,共19个mi RNA差异表达,其中8个mi RNA在CD4+PD-1+细胞中表达上调,11个mi RNA在CD4+PD-1+细胞中表达下调。RT-q PCR检测11个mi RNA结果与mi RNA基因芯片一致,其中8个mi RNA(mi R-let-7e、mi R-103、mi R-107、mi R-27a、mi R-23a、mi R-21、mi R-155、mi R-146a)在CD4+PD-1+细胞中表达上调,3个mi RNA(mi R-150、mi R-28、mi R-151-5p)表达下调。mi R-150、mi R-28,mi R-let-7e、mi R-103、mi R-107、mi R-27a和PD-1 3’UTR有结合位点。双荧光素酶试验证实mi R-28和mi R-107可以靶向结合PD-1 3’UTR。结论:在CD4+PD-1+细胞中mi R-150、mi R-28、mi R-151-5p表达下调,mi R-let-7e、mi R-103、mi R-107、mi R-27a、mi R-23a、mi R-21、mi R-155、mi R-146a表达上调。其中mi R-28和mi R-107可以靶向结合PD-1 3’UTR沉默PD-1。提示这些mi RNA有可能成为抗PD-1靶向治疗的有效生物诊断标记或者治疗靶点。第3章耗竭性T细胞在荷瘤小鼠中的表达及体外耗竭性T细胞模型建立目的:比较荷瘤小鼠和正常小鼠体内耗竭性T细胞表型的表达变化,建立耗竭性T细胞体外诱导模型。方法:建立小鼠黑色素瘤模型,分离小鼠淋巴细胞及肿瘤浸润T淋巴细胞,流式细胞仪检测肿瘤浸润T淋巴细胞、淋巴结及脾脏中耗竭性T细胞表型;采用抗CD3e单抗以及抗CD3e单抗联合干扰素-a(interferon-a,IFN-a)或CD28体外诱导耗竭性T细胞,流式细胞仪检测表型变化,RT-q PCR检测mi RNA表达。结果:和正常小鼠相比,荷瘤小鼠体内耗竭性T细胞表型在CD4和CD8 T细胞中表达升高。采用抗CD3e包被法、CD3e联合CD28抗体或IFN-a都可以诱导耗竭性表型,其表达程度与抗CD3e抗体浓度相关。在T细胞体外培养过程中mi RNA表达下降。结论:在肿瘤生长过程中,肿瘤细胞可以刺激机体T细胞转化,导致T细胞耗竭。CD3e包被法可以体外诱导耗竭性T细胞,mi RNA表达发生相应改变。第4章mi R-28调控耗竭性T细胞生物学特性的研究目的:检测mi R-28对耗竭性T细胞表型的影响,以及mi R-28对T细胞增殖、凋亡、Treg、分泌细胞因子能力以及细胞毒作用的影响。方法:体外瞬时转染mi R-28 mimic和mi R-28 inhibitor至荷瘤小鼠T淋巴细胞,RT-q RCR比较PD-1、TIM-3、BTLA基因表达,流式细胞仪检测耗竭性T细胞表型以及Treg细胞、Foxp3+PD-1+及Foxp3+TIM-3+细胞比例,琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)检测细胞增殖,Annexin V/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(The enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子分泌;MACs磁珠分选CD8+T细胞,与抗原负载的树突状细胞(dendritic cell,DC)混合共培养,转染mi R-28 mimic和mi R-28 inhibitor后采用非放射性细胞毒性分析检测细胞介导的细胞毒性。结果:mi R-28可以调控耗竭性T细胞相关基因PD-1、TIM-3、BTLA表达,转染mi R-28 mimic降低PD-1+T细胞比例,增加白介素-2(interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor,TNF-a)水平,增强活化的CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。mi R-28 inhibitor增加T细胞PD-1、TIM-3表达,并增加Foxp3+PD-1+和Foxp3+TIM-3+T细胞比例,抑制细胞因子TNF-a的分泌。结论:mi R-28可以调控T细胞表面负调控分子PD-1的表达,促进细胞因子IL-2和TNF-a分泌,影响Foxp3+PD-1+和Foxp3+TIM-3+T细胞表达。mi R-28还可以通过抑制PD-1的表达增强CTLs特异性杀伤肿瘤细胞的能力。mi R-28可以作为一个新的靶向治疗的方法,通过抑制PD-1使机体恢复抗肿瘤免疫能力,达到治疗肿瘤的目的。