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第一部分茶黄素通过调节氧化应激减少肾脏草酸钙晶体沉积及肾小管上皮细胞损伤的作用研究【目的】晶体诱导的细胞氧化损伤在草酸钙肾结石形成的早期阶段发挥着关键作用,小管上皮细胞损伤后会导致细胞表面黏附蛋白合成增多,进一步促进结晶的黏附聚集。本部分研究拟探讨茶黄素对晶体细胞损伤和肾脏草酸钙晶体沉积的的作用和影响。【方法】在动物实验中,将30只6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为5组,利用腹腔注射乙醛酸构建结晶性肾损伤模型:正常对照组、结晶性肾损伤模型组、低剂量茶黄素治疗组（20 mg/kg）,中剂量茶黄素治疗组（50 mg/kg）和高剂量茶黄素治疗组（100 mg/kg）。偏光显微镜和Pizzolato染色观察小鼠肾组织中结晶沉积情况;PAS染色和原位TUNEL荧光染色评估肾小管损伤和细胞凋亡情况;DHE法检测肾组织中ROS生成水平;IHC染色检测小鼠肾脏中氧化应激相关蛋白NOX2、SOD2和成石相关蛋白CD44、OPN的表达情况;测定小鼠血清肌酐和尿素氮水平。在细胞实验中,CCK-8法检测HK-2细胞增殖活性确定茶黄素治疗浓度,然后根据处理方式分为4组:正常对照组、COM处理组、20μg/ml茶黄素治疗组、50μg/ml茶黄素治疗组。检测和评估各组细胞的细胞凋亡情况,ROS生成水平,H2O2、LDH、MDA和SOD表达情况,成石相关蛋白CD44、OPN的表达水平以及晶体对小管上皮细胞的黏附情况。【结果】我们成功建立了小鼠结晶性肾损伤模型,造模组小鼠肾脏草酸钙晶体沉积数量,小管损伤程度和细胞凋亡数量,ROS生成水平,CD44、OPN的表达水平,血清肌酐和尿素氮水平显著高于正常对照组。而在茶黄素治疗组,上述各指标水平均明显低于造模组,且降低效果与治疗剂量呈正相关。细胞实验中,≤50μg/ml的茶黄素浓度对HK-2细胞活性无明显影响。COM晶体处理后,细胞凋亡数量、ROS生成水平、H2O2、LDH、MDA和SOD表达水平、成石相关蛋白CD44、OPN的表达水平和晶体黏附量均明显高于正常对照组,而经茶黄素预处理后,这些指标水平均发生逆转,且50μg/ml茶黄素效果优于20μg/ml茶黄素。【结论】茶黄素能够抑制氧化应激,改善结晶性肾损伤,减少草酸钙晶体的黏附和沉积,进而可能发挥抑制草酸钙肾结石形成作用。第二部分茶黄素通过mi R-128-3p/SIRT1轴减轻草酸钙晶体诱导的肾脏氧化损伤的机制研究【目的】在第一部分研究中,我们证实了茶黄素具有减少肾脏草酸钙晶体沉积和肾小管上皮细胞损伤的功效。在该部分研究中我们将进一步探究茶黄素对草酸钙晶体诱导的肾脏氧化损伤发生保护的潜在分子机制机制,尤其是mi R-128-3p/SIRT1轴在其中扮演的角色。【方法】在小鼠实验中,首先通过IHC染色和q PCR检测造模和接受茶黄素预处理的小鼠肾脏中SIRT1的表达情况,通过FISH染色和q PCR检测小鼠肾脏中mi R-128-3p的表达情况,然后利用Pearson相关系数分析评估SIRT1和mi R-128-3p的表达关系。在细胞实验中,分别检测COM晶体和/或茶黄素预处理后SIRT1和mi R-128-3p的表达水平,通过双荧光素酶报告实验、q PCR和western blot明确mi R-128-3p对SIRT1的表达调控作用。最后利用mi R-128-3p mimic和Agomir-128分别在HK-2细胞和小鼠肾脏中激活上调mi R-128-3p的表达,通过一系列体内外实验观察茶黄素通过调节mi R-128-3p/SIRT1轴对草酸钙晶体诱导的氧化应激、结晶性肾损伤以及晶体对肾小管上皮细胞的黏附沉积的作用和影响。【结果】首先在小鼠实验中,我们发现乙醛酸诱导肾脏草酸钙结晶沉积模型时会降低SIRT1的表达同时升高mi R-128-3p的表达,而茶黄素治疗可使SIRT1表达升高而mi R-128-3p表达降低,通过Pearson相关系数分析也证实SIRT1与mi R-128-3p表达呈负相关。在细胞实验中我们同样发现COM晶体处理小管上皮细胞后会降低HK-2细胞中SIRT1的表达同时升高mi R-128-3p的表达,而茶黄素治疗可逆转它们的表达变化。通过双荧光素酶报告实验、q PCR和western blot的实验结果也证明了mi R-128-3p能够直接靶向SIRT1的3’-UTR抑制其表达。最后,进一步的细胞和动物实验结果也说明激活mi R-128-3p可加重草酸钙晶体诱导的氧化应激、细胞凋亡和结晶黏附沉积,同时还会部分逆转茶黄素对SIRT1的表达上调作用以及对结晶引起的肾脏氧化损伤的保护作用。【结论】在草酸钙晶体引起的肾脏损伤中,茶黄素可上调SIRT1表达和下调mi R-128-3p表达,降低肾脏氧化应激压力,减少晶体黏附沉积。调控mi R-128-3p/SIRT1轴可能是茶黄素抑制结晶性肾损伤发挥肾脏保护功能的重要途径。茶黄素有望为开展草酸钙肾结石防治工作提供新的思路和选择。