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目的Fas也称Apo-1或CD95,是肿瘤坏死因子（TNFR）/神经生长因子受体（NGFR）家族的一个代表,在生理和病理的凋亡过程中广泛涉及,如肿瘤监视、免疫功能、爆发性肝炎和神经再生等。Fas曾经在抗癌治疗中被使用,然而在治疗应用上Fas受到很大限制,这是由于它的毒性和激活NF-κB家族转录因子,NF-κB易引起炎症和抗凋亡的作用。在体外,为了克服这些问题,特殊的NF-κB抑制剂、转录和蛋白合成抑制剂放线菌素D被应用,通过放线菌素D（actinomycin D,AD）处理细胞,使对Fas抗体介导的凋亡不敏感的细胞株变得敏感,这是由于放线菌素D能激活细胞内信号,在诱导凋亡过程中提供了与Fas协同的共刺激信号,从而促进细胞凋亡。凋亡或程序性死亡在胚胎形成和发展中是重要的现象,它维持着机体的自我平衡。对于敏感细胞,当Fas受体与Fas配体或可溶性Fas抗体相结合时,Fas受体三聚化作用导致细胞凋亡。对于Fas抗体诱导细胞凋亡的分子机制已经进行了初步的研究,在Fas-AD诱导的细胞凋亡过程中可以激发多个信号途径,其中以caspase蛋白激酶执行细胞有秩序的死亡而闻名。在哺乳动物细胞,凋亡是以依赖线粒体途径和非依赖线粒体途径两条途径促进细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在调节线粒体凋亡途径中起到一个中心作用。Bcl-2家族蛋白的作用位点主要在线粒体膜上,能刺激线粒体细胞色素C的释放,细胞色素C与Apaf-1一起激活caspase-9,caspase-9激活caspase-3随之导致凋亡。对于非依赖线粒体途径:主要通过死亡受体（Fas associated death domain,FADD）作用激活caspase-8,进而激活下游的caspase-3,从而引起细胞凋亡。caspase-8除了直接激活caspase-3外,还可以通过内质网通路间接激活caspase-3。在两个途径中,最后步骤涉及到依靠大量的多蛋白复合体caspase从钝化的形式变为激活形式,一旦激活,caspase断裂各种底物导致细胞死亡,在此过程中caspase-8是顶端的caspaLse,对于启动Fas诱导的凋亡是非常重要的。在caspase亚家族中,对于理解凋亡,caspase-3由于其易变底物的特殊性而尤其重要。RB肿瘤抑制蛋白在通过G1/S调控点调节细胞周期中起主导作用,参与细胞周期的调节。通常认为失活的RB在G1/S临界点通过磷酸化释放E2F转录因子诱导细胞周期基因表达,加速S期进入引起细胞增殖。RB还有很多其他的细胞功能,包括介导分化的信号,在有丝分裂过程中调节染色体分离,维持基因的完整性。扰乱这些RB功能的途径能潜在的引起增殖的增高或基因的不稳定导致肿瘤的发生。有丝分裂原蛋白激酶已经被暗示是凋亡的上游信号,包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5亚家族。在哺乳动物细胞,它们是由不同的外界刺激物（如紫外线和渗透性刺激等）调节的独立模型,通过传导不同信号导致细胞的增殖、分化和凋亡。在死亡受体诱导凋亡的过程中,这个途径的作用还不太清楚,可能依靠特殊的死亡受体和细胞类型。目前,关于Fas-AD诱导Bel-7402肿瘤细胞凋亡的过程中,P38MAPK与caspase-8是否一起参与,P38MAPK与caspase家族之间的关系,以及P38MAPK、caspase与Bcl-2、Rb的关系还不清楚,本研究利用Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡,通过P38MAPK抑制剂SB203580及caspase-8抑制剂Ac-IEFD-cho的作用,来确定P38MAPK、caspase-8、caspase-3及Bcl-2、RB的关系,进一步揭示Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡的信号转导机制。方法1、通过MTT法检测Fas-AD作用后的Bel-7402细胞活力,在Fas抗体不同浓度下的不同作用时间点检测。2、通过倒置显微镜、电子显微镜和流式细胞仪检测Fas、Fas-AD、SB203580（P38MAPK特异性抑制剂）及Ac-IEFD-cho（caspase-8特异性抑制剂）对Bel-7402细胞凋亡的影响。3、通过Western-blot法、RT-PCR法检测Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho对培养的Bel-7402细胞的P38MAPK、caspase-8、caspase-3的激活作用,对FasR、Bcl-2、RB表达的影响及其可能的信号转导通路。4、利用激光共聚焦显微镜通过免役荧光法检测Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho作用后P38MAPK与caspase-3的细胞内定位。5、通过免疫沉淀法确定P38MAPK与caspase-3的作用关系,caspase-3与RB的作用关系及其可能的信号转导通路。结果1、Fas-AD能明显抑制Bel-7402细胞增殖,且随Fas抗体浓度及其作用时间呈依赖关系。2、Fas-AD能明显诱导Bel-7402细胞凋亡,SB203580和Ac-IEFD-cho能明显抑制Fas-AD诱导的细胞凋亡。倒置显微镜下观察显示,Fas-AD作用24h后能明显地诱导Bel-7402细胞凋亡,细胞质出现大量空泡,核仁的数量减少,死亡细胞较多。SB203580和Ac-IEFD-cho分别单独作用时能改善这种现象,死亡细胞相对较少;当两个抑制剂共同作用时能明显改善这种现象,细胞质出现微量小泡,核仁较多。电子显微镜下观察显示,Fas-AD作用24h后,Bel-7402细胞出现典型的凋亡特征,细胞体积变小,胞质浓缩,胞浆内空泡增多,染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状,出现凋亡小体。SB203580组和Ac-IEFD-cho组可见细胞膜相结构完整,胞浆内空泡相对减少,染色质边缘聚集,线粒体肿胀。SB203580和Ac-IEFD-cho共同作用组,未出现明显的凋亡特征,胞浆可见少量小泡。Annexin-V FITC/PI双标流式细胞术分析显示:Fas-AD作用24h后,与对照组比较Fas-AD组能明显诱导Bel-7402细胞凋亡,凋亡率为50.55±3.25%,SB203580和Ac-IEFD-cho单独或共同作用都能明显的抑制Fas-AD诱导的凋亡。3、Fas-AD能明显诱导Bel-7402细胞FasR表达。Western-blot结果显示,Fas-AD诱导培养的Bel-7402细胞的FasR表达,并且FasR随Fas抗体浓度呈剂量依赖性增加,但当Fas抗体浓度为10μM时,FasR表达增加量减缓。4、P38MAPK与caspase-8参与Fas-AD凋亡途径,并且相互调节。P38MAPK抑制剂SB203580和caspaLse-8抑制剂Ac-IEFD-cho阻碍Fas-AD诱导凋亡的作用明显显示,P38MAPK和caSpase-8在Fas-AD诱导的凋亡中起重要作用。5、在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中,通过抑制剂SB203580和Ac-IEFD-cho的作用发现P38MAPK和caspase-8调节Bcl-2、Rb的表达,P38MAPK和caspase-8能明显地降低Bcl-2的表达,增加RB的表达。6、P38MAPK和caspase-8调节caspase-3的表达。Western-blot结果显示,Fas-AD诱导caspase-3表达并发生断裂激活,并且断裂片段表达随Fas抗体浓度增加呈剂量依赖性增加,而抑制剂SB203580和Ac-IEFD-cho能明显地抑制其表达和激活。7、当Fas-AD作用Bel-7402细胞24h时,在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中P38MAPK与caspase-3从细胞质转位到细胞核形成P38MAPK/caspase-3复合体,而抑制剂SB203580和Ac-IEFD-cho能明显地抑制他们的转位。8、当Fas-AD作用Bel-7402细胞48h时,caspase-3与RB相互作用并形成caspase-3/Pd3复合体。结论1、Fas-AD抑制Bel-7402细胞增殖,诱导Bel-7402细胞凋亡。2、Fas-AD经P38MAPK、caspase-8信号通路诱导Bel-7402细胞凋亡。3、在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中,P38MAPK与caspase-8相互调节,不仅从蛋白总量而且还从激活（磷酸化形式或断裂形式）的表达上相互影响,再有从mRNA水平也相互调节。4、Fas-AD通过激活P38MAPK、caspase-8从而引起caspase-3的激活,作用下游底物Bel-2、RB调节其表达。5、在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡过程中,P38MAPK与caspase-3从细胞质转位到细胞核,短暂作用形成P38MAPK/caspase-3复合体,调节caspase-3的表达,当P38MAPK/caspase-3复合体分离后,caspase-3与RB形成复合体进而调节RB的表达,从而引起细胞凋亡。