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本论文以禽贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)为研究对象，扩增了该虫IT-1+序列作为遗传标记，研制了贝氏隐孢子虫感染的PCR诊断试剂盒，并应用该试剂盒对广东省广州、佛山两地部分禽类进行了检测。
运用基因分析软件DNAstar(v4.0)比较GenBank中发表的隐孢子虫rDNA序列，设计一对包含ITS-1基因的引物(CR18F：5’-CCGTTCTTAGTTGGTGGAGT-3和CR5-8R：5’-TGCTGCGTTCCTTCATCGTTAT-3’)，对本次实验收集的贝氏隐孢子虫GD株以蛋白酶K消化抽提DNA后进行了PCR扩增和酶切鉴定，PCR扩增产物电泳的目的条带和酶切的目的条带均是892bp。将PCR产物纯化后分别与pMD18-T载体连接并转化、涂板、培养后，在选择培养基中挑取白色单菌落培养后抽提质粒，将重组质粒用KpnⅠ、Hind Ⅲ进行双酶切和PCR鉴定，证明目的片段已插入到载体中。然后对PCR产物进行测序和序列分析，将18S rRNA基因和ITS-1基因序列经BLAST比较后从www．ncbi.nlm.nih．gov-的GenBank上下载了各种隐孢子虫相应序列，对这些序列进行相似性分析发现，18S部分区间和ITS-1与GenBank上注册的其它隐孢子虫存在种间差异，而且差异显著，为贝氏隐孢子虫所特有。因此，可以在此片段内设计种特异性引物，通过PCR方法来鉴别各种隐孢子虫；也可根据各种隐孢子虫本身的ITS-1片段长度不同，在ITS-1的两侧翼(18S和5.8S)设计属特异性引物，依据扩增片段大小来区分不同的隐孢子虫。总的说来，18S和ITS-1片段可以作为建立PCR鉴别诊断的靶序列，能够提供足够的遗传标记。
根据贝氏隐孢子虫18S和ITS-1序列，选取了存在遗传标记位点最多的一段核苷酸序列作为特异PCR引物的靶序列，设计、合成了一对针对贝氏隐孢子虫的特异性引物(YJWF：5’-ACTGATATACAATACGG-3和YR:5’-GCGGATAAAGTTCAGGTTC-3)，对PCR的反应条件进行了一系列优化，确定了试剂盒的组成：①PCR反应液主要包括10×PCR Buffer，终浓度为1.5mM的MgCl2，终浓度为2001μM的dNTP，终浓度各0.5μM的引物YJWF/YR。Taq酶(5U/μL)按每个PCR反应(25μL)0.125μL加入，反应液不含Taq酶。②DNA裂解液：100mM NaCl，20mM Tris-HC1(pH=8.0)，25mMEDTA(pH=8.0)，1％(w/v)SDS和4μg/μL Proteinase K。③试剂盒的配制：每个试剂盒内主要含反应液5管(25μL/反应×20)；20支PCR反应管；2.0g琼脂糖(Agarose)；
100μL溴化乙锭(10μg/μL)；6×10ading buffer 100μL；5μL Taq酶(5U/μL)；1支阳性对照。分别对试剂盒的特异性、敏感性、稳定性、重复性和保存期等进行了系统的研究。在特异性试验中，仅贝氏隐孢子虫扩增出约1100bp的特定片段，而安氏隐孢子虫，微小隐孢子虫，柔嫩艾美尔球虫，毒害艾美尔球虫，毛滴虫，弓形虫等均无此扩增条带；试剂盒最低可检测到3.48个隐孢子虫卵囊；反复冻融50次对试剂盒的检测结果没有影响；试剂盒在-20℃和4℃的保存期至少在6个月以上，具有良好的稳定性；重复性实验中4个不同批次的试剂盒对9份贝氏隐孢子虫阳性样品均能扩增出明亮的目的条带，而对阴性样品的PCR扩增结果全为阴性。上述研究结果表明该试剂盒的各项指标基本达到了贝氏隐孢子虫PCR检测的要求。应用该试剂盒对广东省广州、佛山两地禽类共215份样品进行了贝氏隐孢子虫感染的实际检测，并与常规检测方法饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法进行了比较。本试剂盒的检出率比常规检测方法提高了4.540％～6.25％，显示该试剂盒具有特异、敏感等优点，对开展隐孢子虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查具有重要的应用价值。