论文部分内容阅读
目的观察乌司他丁对脂多糖诱导损伤的早期内皮祖细胞数量和功能及Tie2、AKT、eNOS的表达变化,探讨乌司他丁调节脂多糖诱导损伤内皮祖细胞功能的机制。方法1.采用密度梯度离心法提取人外周血内皮祖细胞,通过免疫荧光技术及细胞形态对内皮祖细胞进行鉴别。2.不同浓度的LPS(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)刺激损伤内皮祖细胞4h,观察内皮祖细胞迁移、黏附和增值能力,蛋白印迹法检测细胞内Tie2的蛋白表达。3.不同浓度的UTI(0IU/ml、200IU/ml、400IU/ml、800IU/ml、1600IU/ml)共育LPS刺激损伤的EPC12小时,观察细胞迁移、黏附和增值能力,蛋白印迹法检测不同UTI浓度下EPC内Tie2、AKT的磷酸化表达水平。4.将细胞分为EPC组、EPC+LPS组、EPC+LPS+UTI组,LY294002和L-NAME分别抑制PI3K和eNOS后检测内皮祖细胞内AKT及eNOS的磷酸化表达水平并观察细胞的迁移、黏附和增值能力。结果1.分离后可见单个核细胞,体积小且成圆形;培养至第4天可见少量细胞集落形成;第7天的细胞体积变大且大部分呈梭形;第14天的EPC大部分呈卵圆形或铺路石样改变,与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形态相似。2.培养第7天的EPC吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL),同时结合FITC标记的外源凝集素(Lectin)。3.LPS处理EPC 4小时后,EPC的黏附(*P<0.05 vs.10ng/ml组;#P=0.056 vs.0ng/ml组,N=6)、迁移(*P<0.05 vs.10ng/ml组;#P=0.074vs.0ng/ml组,N=6)、增值(*P<0.05 vs.10ng/ml组;#P=0.588 vs.0ng/ml组,N=6)能力在浓度为10ng/ml LPS时明显下降,内皮祖细胞内Tie2的表达亦明显下降(*P<0.05 vs.10ng/ml组;#P=0.273 vs.0ng/ml组,N=6)。4.UTI处理受损内皮祖细胞12小时后,EPC的黏附、迁移、增值能力在浓度为800IU/ml UTI时明显增强(*P<0.05 vs.LPS+0IU UTI组;#P<0.05 vs.LPS+800IU UTI组,N=6),内皮祖细胞内Tie2、AKT的磷酸化水平均较LPS+0IU UTI组明显升高(*P<0.05 vs.LPS+0IU UTI组,#P<0.05vs.LPS+800IU UTI组,N=6)。5.LY294002和L-NAME分别抑制PI3K和e NOS后,蛋白印迹结果显示,内皮祖细胞内AKT和eNOS的磷酸化水平表达明显下降(*P<0.05vs.EPC+LPS组,#P<0.05 vs.EPC+LPS+UTI组,N=6),内皮祖细胞的黏附、迁移及增值(*P<0.05vs.EPC+LPS组,#P<0.05 vs.EPC+LPS+UTI组,N=6)能力较未抑制组明显下降。结论乌司他丁能够增强体外脂多糖诱导损伤的内皮祖细胞的黏附、迁移和增值能力,其机制可能与激活Tie2信号通道有关。