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背景纳米氧化锌(Zinc Oxide Nanoparticles, ZnO-NPs)是目前世界上产量较高的纳米材料之一,可通过呼吸道吸入引起肺部炎症；此外,ZnO-NPs粒子还可能通过肺气血屏障进入血液循环,进一步穿透血脑、血眼及血睾等多种生物屏障系统,对身体主要脏器造成损害。流行病学及毒理学研究发现ZnO-NPs可诱导人类心脏微血管内皮细胞渗透性改变及炎性反应,造成内皮细胞损伤,甚至动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)。ZnO-NPs对心血管内皮细胞损伤尤其是AS改变的作用机制目前还不清楚。研究发现AS发生时血管内皮细胞凋亡增加,血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)及血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecules-1, PECAM-1)表达均明显增加。为此,该研究利用人肺泡上皮细胞A549和冠状动脉内皮细胞(Human Coronary Artery Endothelial Cell, HCAEC)共培养系统,模仿肺部气血屏障,探讨ZnO-NPs是否会引起HCAEC损伤及HO-1和PECAM-1表达水平的变化；然后分别用基因转录抑制剂放线菌素D(Actinomycin D, Act D)以及胞噬作用抑制剂细胞松弛素B(Cytochalasin B, CB)抑制A549细胞蛋白的合成及ZnO-NPs对HCAEC直接刺激,来抑制ZnO-NPs对HCAEC的间接及直接作用。初步探讨其对HCAEC的影响及其作用机制,为阐明ZnO-NPs颗粒的动脉内皮细胞毒性及其机制、制定有效的防治措施和卫生标准提供分子生物学依据。目的利用A549/HCAEC共培养模型以及HCAEC直接作用模型,测定国产ZnO-NPs (30 nm)对HCAEC的损伤作用以及对细胞HO-1和PECAM-1蛋白表达的影响及其可能机制。方法1. ZnO-NPs对共培养模型的影响：(1)共培养模型：共培养系统示意图见正文方法部分。在该培养体系中,A549细胞接种于上室Transwell上面,与接种在下室的HCAEC由0.4μm滤膜隔离。(2)细胞毒性测定：待A549细胞长满后,用MTT法测定A549的死亡率。(3) HCAEC培养上清中HO-1及PEC AM-1浓度的测定：用ZnO-NPs刺激上室的A549细胞24 h,收集下室培养液,ELISA法测定HO-1与PECAM-1蛋白浓度。(4)基因转录抑制剂Act D和胞噬作用抑制剂CB对HO-1及PECAM-1表达的影响：用1μg/mlActD及10μg/ml CB分别预处理A549细胞,30 min后收集下室培养液,ELISA法检测其中HO-1与PECAM-1蛋白浓度。2. ZnO-NPs对HCAEC的直接作用：将ZnO-NPs直接刺激HCAEC,依照上述方法测定HCAEC死亡率及培养液上清中HO-1与PECAM-1的浓度。3.锌浓度测定：在两种实验模型中,均使用火焰原子吸收光谱法测定HCAEC细胞内外锌含量。4.应用SPSS 12.0软件分析处理实验数据,两组及多组间比较采用t检验及单因素方差分析；抑制剂对实验组与对照组指标的变化采用2×2析因设计方差分析。检验水准为α=0.05。结果ZnO-NPs对共培养体系中HCAEC的影响：1细胞毒性：ZnO-NPs可抑制A549细胞增殖,致死率随ZnO-NPs浓度的增加而上升,呈剂量反应关系。当ZnO-NPs浓度为100μg/ml时,细胞致死率约为50%。2 HO-1与PECAM-1蛋白水平：用不同浓度(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml) ZnO-NPs刺激共培养模型中A549细胞24 h后,HO-1及PECAM-1的浓度随ZnO-NPs浓度的升高而逐渐增加,与对照组相比差异均具有统计学意义(F=66.927,P<0.001；F=321.842,P<0.001)。3 HCAEC细胞内锌含量：用不同浓度(同上) ZnO-NPs刺激共培养模型中A549细胞24 h后,细胞内锌含量随ZnO-NPs浓度的升高而逐渐增加。20μg/m1和40μg/m1ZnO-NPs组细胞内锌浓度均较对照组有明显升高(F=93.884,P<0.001)。4 ActD对HO-1及PECAM-1表达的影响：在DMSO组,与对照组相比,ZnO-NPs可诱导HO-1与PECAM-1水平显著升高(F=175.509,P<0.001；F=181.124,P<0.001)；在Act D组,虽然与对照相比ZnO-NPs也能诱导HO-1与PECAM-1水平的高表达,但较DMSO组ZnO-NPs的作用明显降低(t=2.885,P=0.045；t=2.975,P=0.041),即ActD可明显抑制ZnO-NPs所致HO-1与PEC AM-1的表达。5 CB对HO-1及PEC AM-1表达的影响：在DMSO组,与对照组相比,ZnO-NPs可诱导HO-1与PECAM-1水平显著升高(F=89.738,P<0.001；F=116.241,P<0.001)；在CB组,ZnO-NPs对HO-1与PECAM-1表达诱导作用虽然高于对照,但与DMSO组ZnO-NPs相比,其作用强度明显减弱(t=5.038,P=0.007；t=3.392,P=0.027),即抑制A549细胞的吞噬作用可降低ZnO-NPs对内皮细胞HO-1与PECAM-1表达的诱导作用。ZnO-NPs对HCAEC直接作用结果：1.细胞毒性：ZnO-NPs对HCAEC直接作用后,可抑制细胞增殖、增加细胞死亡率,该作用呈现剂量依赖性。2.HO-1与PECAM-1的表达：不同浓度ZnO-NPs刺激HCAEC 24 h后,培养液上清中HO-1与PECAM-1水平均随ZnO-NPs浓度的升高而升高,20μg/ml和40μg/ml ZnO-NPs组HO-1及PECAM-1的浓度均较对照组有明显升高(F=145.228,P<0.001；F=295.535,P<0.001)。3. HCAEC细胞内、外锌的含量：细胞外培养液中及细胞内锌含量均随ZnO-NPs浓度的升高而增加,与对照组相比差异有统计学意义(F=12957.464,P<0.001；F=7021.460,P<0.001)。结论1. ZnO-NPs对人肺泡上皮细胞和人冠状动脉内皮细胞均有损伤作用。2. ZnO-NPs刺激可诱导人冠状动脉内皮细胞HO-1和PECAM-1表达量升高,即引起动脉粥样硬化性分子学改变。3. ZnO-NPs可能通过胞噬过程进入肺泡上皮细胞,进而诱导肺泡上皮细胞释放细胞介素上调动脉内皮细胞PECAM-1与HO-1的表达。4.共培养系统中HCAEC中锌浓度的提高提示ZnO-NPs可能穿透肺泡上皮细胞进入下室培养液(相当体内的血液循环),进而进入内皮细胞从而致内皮细胞内锌含量增加。5. ZnO-NPs可通过间接(通过肺泡上皮细胞)和直接作用诱导动脉内皮细胞发生动脉粥样硬化性分子学改变。