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目的探索石斛抗糖尿病性白内障有效成分的作用机制,为其开发利用奠定基础。方法1.采用紫外分光光度计法进行酶动力学抑制实验,研究石斛酚、丁香酸对醛糖还原酶(aldose reductase, AR)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的抑制率及抑制类型。2.应用分子对接软件Sybyl7.3、MOE预测石斛酚与AR、丁香酸与AR以及石斛酚、丁香酸与AR协同作用时的氨基酸作用位点、作用力,模拟石斛酚、丁香酸的药效团。进行动力学模拟,验证石斛酚、丁香酸与AR对接结果稳定性,可靠性。3.采用冷喷雾质谱技术(CSI-MS),研究石斛酚和丁香酸与醛糖还原酶的非共价结合能力,测定非共价结合复合物的相对分子量及结合计量比。4.通过分子对接软件Discover Studio2.1, Gaussian03W软件预测石斛酚、丁香酸的药代动力学性质,考察其成药性。结果1.石斛酚对AR的抑制作用机制：1.1石斛酚对AR的IC50=2.12mmol/L,抑制类型为反竞争性抑制,石斛酚对AR抑制关系呈现的良好的量-效关系。1.2石斛酚与AR对接结果表明作用氨基酸残基为Trpl11 His110 Tyr48,、Trp20,主要作用力是疏水力、氢键和范德华力；氢键供体为石斛酚苯环4位上羟基中的氢,氢键受体为苯环3’位上羟基中的氧,疏水基为芳香环；分子动力学模拟的轨迹结果表明石斛酚与AR的均方根偏差(RMSD)计算结果的轨迹均稳定,石斛酚与其中一个氨基酸残基Hisll结合的轨迹RMSD值亦在正常范围内,验证了对接结果的稳定性及可靠性。2.丁香酸对AR的抑制作用机制：2.1丁香酸对AR半数抑制浓度IC50=13.6mmol/l,丁香酸对AR的抑制作用为反竞争性抑制,丁香酸与AR的抑制关系呈现明确的量-效关系。2.2丁香酸与AR对接结果表明作用氨基酸残基为Trpl11、His110、Tyr48,主要作用力为疏水力和氢键；氢键受体为丁香酸中8位羟基中的氢,疏水基为芳香环；分子动力学模拟的轨迹结果表明丁香酸与AR的RMSD计算结果的轨迹稳定可靠。3.石斛酚与iNOS对接结果表明作用氨基酸为llel95、Gln257,主要作用力为氢键。4.石斛酚、丁香酸与AR协同作用时,对接结果表明二者和AR之间的主要作用氨基酸为Asn160、Trp209,并且形成π-π共轭,形成更为稳定的氢键,主要作用力为氢键；石斛酚、丁香酸与AR协同体氢键受体为丁香酸连接3位苯环的甲氧基中的氧和石斛酚右苯环5位上甲氧基中的氧,氢键供体为丁香酸连接3位苯环的甲氧基中的氢,丁香酸、石斛酚上的苯环均为疏水芳香环。5.CSI-MS测试表明石斛酚与AR、丁香酸与AR的摩尔质量比均为27：1,二者结合复合物分子量最大,石斛酚及丁香酸浓度降低或增高,结合的量逐渐减少；pH和温度对于二者结合没有太大影响。6.通过模型预测石斛酚、丁香酸的药代动力学性质,结果表明石斛酚、丁香酸的被动肠内吸收和水溶性很好；石斛酚血脑屏障通过率低,丁香酸血脑屏障通过率高；石斛酚对CYP450 2D6酶有抑制作用,丁香酸对CYP450 2D6酶无抑制作用；石斛酚有一定的肝毒性：丁香酸无肝毒性；石斛酚、丁香酸均未与血浆蛋白结合,为游离型,具有药物活性。结论1.酶动力学检测得到石斛酚、丁香酸对AR和iNOS呈现一定的抑制活性。2.石斛酚、丁香酸与AR、iNOS的结合模式表明石斛酚、丁香酸与AR以及石斛酚与iNOS均有较稳定的结合,作用氨基酸残基包括热点残基Trplll, His110, Tyr48,作用力为氢键、疏水力和范德华力,且形成π-π共轭,为研究石斛酚与丁香酸对AR及iNOS的抑制奠定基础;动力学模拟表明石斛酚、丁香酸与AR的动力学模拟结果轨迹的RMSD均在正常范围内,具有稳定可靠性；石斛酚、丁香酸与AR、iNOS的作用构效关系研究结果表明石斛酚、丁香酸对AR、iNOS有稳定可靠的构效关系。3.CSI-MS测试表明石斛酚、丁香酸与AR之间具有较好的结合性,且pH和温度对其结合没有明显影响。4.药代动力学研究表明丁香酸具有良好的成药性,石斛酚有一定肝毒性,但本实验是研发石斛抗糖尿病性白内障滴眼液外用药,可不经过消化系统,故石斛酚一定的肝毒性对石斛酚成药性没有影响。