猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)引起的传染病。自1987年发现以来，该病给全球的养猪业带来很大损失。PRRSV具有持续感染、易变异以及非中和抗体介导的再感染等特性，使该病的防控变得更加复杂。PRRSV是基因组长约15kb的RNA病毒，具有10个ORFs。ORF1a和ORF1b编码与病毒复制相关的酶，ORF2a、ORF2b、ORF3～7以及ORF5a编码结构蛋白，其中M、GP5结构蛋白含有酪氨酸的受体抑制基序(ITIM)，病毒蛋白中的ITIM基序磷酸化激活后可以招募胞内蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2等调控分子，进而调节细胞内T型干扰素(IFN-Ⅰ)的信号通路。IFN-Ⅰ是天然免疫中关键的抗病毒分子，PRRSV感染早期可激活IFN-Ⅰ的产生，而后期则抑制。PRRSV诱导IFN-Ⅰ产生是动态平衡过程，受多种因素调控。本实验室先前研究表明，PRRSVM结构蛋白中的ITIM基序能激活IFN-β的产生。分析显示GP5蛋白中的77～82氨基酸位置也存在ITIM基序，因此本试验对GP5蛋白中ITIM基序调控IFN-β的产生机制进行了初步研究，这可完善PRRSV感染免疫机制。
　　依据Genbank中PRRSV GP5基因设计含酶切位点的引物，以本实验室保存的PRRSV VR2332毒株为模板扩增GP5基因片段，克隆到空载体pcDNA3.0中，构建pcDNA3.0-GP5重组表达载体。运用重叠延伸PCR技术，设计两对引物，将缺失ITIM基序后的两个片段连接，从而构建pcDNA3.0-GP5ΔITIM重组表达载体。保存这两个重组表达载体，并备用。
　　将空载体pcDNA3.0、重组表达载体pcDNA3.0-GP5和pcDNA3.0-GP5ΔITIM分别转染Marc-145细胞，同时设置Marc-145细胞空白对照组，用荧光定量PCR方法检测MyD88、TRIF、TRAF6、NF-κB、IRF3、IRF7、IFN-βmRNA转录水平，结果显示，GP5蛋白中的ITIM基序能够上调细胞中TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7和IFN-βmRNA转录水平，对MyD88、TRAF6mRNA转录水平无明显调节作用，该结果表明GP5蛋白中ITIM基序可能调节TRIF介导的IFN-β激活的信号通路。然后将Poly(I:C)分别和重组质粒共转染细胞，然后用荧光定量PCR方法检测MyD88、TRIF、TRAF6、NF-κB、IRF3、IRF7、IFN-βmRNA转录水平，该试验结果表明，GP5蛋白中的ITIM基序可进步卜调由Poly(I:C)刺激产牛的TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7和IFN-βmRNA转录水平。进一步证明了PRRSV GP5蛋白中ITIM基序通过TLR3-TRIF依赖型信号通路激活调节IFN-β产生。
　　本试验运用RNA干扰技术分别沉默Marc-145细胞中的SHP-1和SHP-2靶基因，将构建的重组质粒pcDNA3.0-GP5与pcDNA3.0-GP5ΔITIM转染沉默靶基因的Marc-145细胞，通过荧光定量PCR方法榆测TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7、IFN-βmRNA转录水平，试验结果显示，沉默SHP-1基因后，GP5蛋白中的ITIM基序对TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7和IFN-βmRNA转录水平的上调作用消失。沉默SHP-2基因后，ITIM基序对TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7和IFN-βmRNA转录水平调节变弱，规律不明显。本试验结果表明，SHP-1可能是PRRSV GP5蛋白中的ITIM基序激活IFN-β产生的信号转导途径中的关键接头分子，而ITIM基序与SHP-2的关系还需要进一步深入探索。本试验探究了PRRSV GP5中ITIM基序对促进IFN-Ⅰ产生的调节作用，为明确PRRSV感染激活IFN-Ⅰ产生的平衡调控机制提供一定参考价值。