猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS),是世界范围内威胁养猪业的重要疾病之一,主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病。虽然各国在防控PRRS方面投入了巨大财力,但并未消除PRRSV在全世界范围内的流行与传播。传统的快速诊断PRRSV抗原或抗体的方法包括逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断技术以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但RT-PCR技术的高灵敏度会导致假阳性结果的出现,而商品化的ELISA诊断试剂盒价格昂贵,因此,寻找特异性高而又价格低廉的诊断PRRS的方法势在必行。近几年来,随着DNA重组技术以及蛋白质工程技术日趋成熟,基因工程抗体被大规模生产以应用于临床疾病的诊断。重组抗体具有制备时间短,生产成本低,便于改造,而且能特异性识别病原微生物等优点,在动物疾病(如PRRS)的鉴别和诊断方面具有广阔前景。为制备与PRRSV具有反应活性的猪源化原核表达抗体(PrAb),本实验通过流式细胞术,以含保守表位的多肽及抗猪IgG抗体,筛选出能够与PRRSV抗原表位结合的阳性B细胞,利用RT-PCR从B细胞中扩增出编码抗体重链可变区(VH)基因序列和轻链可变区(VL)基因序列,将扩增的可VH和VL分别与实验室保存的猪源抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因序列连接后,以Linker序列将轻链和重链全长基因序列相连,构建全长的猪源抗体编码基因(H-linker-L)。将该连接产物克隆至载体pET-28a中,利用原核系统蛋白表达及纯化。Western blot鉴定结果显示,表达的重组蛋白与抗猪IgG抗体结合呈阳性反应,表明表达的重组蛋白为PrAb;经PRRSV包被的ELISA鉴定,PrAb与PRRSV弱毒株CH1R和强毒株HuN4呈阳性反应,表明所制备的PrAb为PRRSV特异性抗体。本实验中,我们建立了利用保守抗原表位及抗B细胞表面抗原抗体筛选特异性B细胞的方法,成功扩增出猪源抗体的VH和VL编码序列,并构建了猪源重组抗体原核表达载体,成功表达出了能和PRRSV特异性结合的猪源重组抗体,为用抗体诊断PRRSV奠定了基础。