【摘 要】
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真核细胞中细胞器在空间上分布不同,各细胞器之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递.Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关,在囊泡运输的
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真核细胞中细胞器在空间上分布不同,各细胞器之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递.Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关,在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径.纤毛虫是单细胞的原生动物,在进化上属于低等的真核生物,但其各细胞器之间囊泡运输系统极为完善.研究Rab蛋白在单细胞真核生物纤毛虫中的功能及阐明囊泡定向运输机理具有重要意义.该研究利用PCR技术从游仆虫(Euplotes octocarinatus)大核DNA中扩增出rab基因,并对该基因进行序列分析,该基因全长为783bp,两端为端粒序列,编码框为624bp,编码207个氨基酸,开放读框中有3个TGA,在此编码半胱氨酸.该基因拟编码的蛋白属于Rab蛋白家族,具有Rab蛋白家族保守的结构特征.系统进化树呈现的规律表明该Rab蛋白可能在囊泡从内质网到高尔基体的运输途径中起作用将游仆虫rab基因(Eo-rab1)构建于克隆载体pGEM-T Easy得重组质粒pGEM-T-Eorab1.以此重组质粒为模板进行PCR定点突变,将Eo-rab1基因中前两个TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGC,获得截短型Eo-rab1基因.以第一次突变后的重组质粒为模板,进行第二次突变,获得全长型Eo-rab1基因.分别将全长型Eo-rab1基因和截短型Eo-rab1基因构建于原核表达载体pGEX-4T-2中,得到重组表达质粒pGEX-Eorab1和pGEX-deEorab1.将重组表达质粒pGEX-Eorab1和pGEX-deEorab1分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.全长型和截短型融合蛋白与抗GST抗体分别在49kD、37kD处有很强的交叉反应.全长型和截短型融合蛋白通过亲和层析柱纯化后经凝血酶酶切分析表明全长型和截短型Eo-rab1基因获得融合表达.全长型融合蛋白经凝血酶酶切和进一步亲和纯化得到达电泳纯的游仆虫Rab蛋白(EoRab1).这为GTPase活性的深入研究,抗体的制备及细胞内定位准备了前提物质.
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