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Rab蛋白(Rab Proteins)是存在于真核细胞内的一种小分子GTP酶(GTPase),其功能是与效应子(effector)协作,参与细胞内膜泡运输的各个阶段,包括膜泡的形成(formation),运动(motility),最终将膜泡锚定(tethering)于特定的目标细胞器上,进而保证细胞内膜泡运输的准确性。每一个真核细胞内都存在多种不同的Rab蛋白,每种Rab蛋白特异性地介导膜泡向特定地细胞器运输,目前已对多种生物细胞内的Rab基因家族多样性做了分析。 纤毛虫是一类低等的单细胞真核生物,在单个细胞内高度集中了维持生命和延续后代所必须的一切功能,细胞内膜泡转运频繁。研究Rab蛋白在其中的功能,有助于了解真核细胞中囊泡定向运输机理。分析该生物中Rab基因的多样性,能够为研究游仆虫中的膜泡运输网络提供框架。 本研究以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为材料,从其大核DNA中克隆得到11种Rab新基因。通过序列分析,将这些基因分别命名为:EoRab1Z,EoRab2a,EoRab2b, EoRab2c, EoRab2d, EoRab6, EoRab7, EoRab43, EoRab2-like, EoRabL2,以及EoRan。从序列同源性角度而言,这些基因涵盖了除Rab5亚家族以外的全部核心Rab蛋白基因,初步揭示了游仆虫细胞内Rab基因的多样性,表明游仆虫内具有基本完善的内膜系统和膜泡运输途径。 在对如上基因进行分析的过程中,我们筛选到了一个编码游仆虫特有Rab蛋白的基因——EoRab43,通过对其拟编码蛋白质的一系列分析,认为该基因编码的蛋白质很有可能参与游仆虫细胞内某些特定的膜泡运输途径。为了鉴定该基因产物在游仆虫细胞内可能执行的功能,我们将其3端的153bp连接到了pGEX-6p-1表达质粒上,转化E.coli BL21(DE3),表达了GST-EoRab4350aa融合蛋白;经SDS-PAGE分析及Western blotting(抗GST标签)鉴定,确定目的蛋白获得了可溶表达。 将GST-EoRab4350aa融合蛋白利用GST亲和层析对其进行了纯化,获得了电泳纯的目的蛋白。纯化的GST-EoRab4350aa融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,抗体效价为1∶60000。用制备的多克隆抗体检测八肋游仆虫的蛋白提取物,表明EoRab43蛋白在游仆虫细胞内表达,同时表明所得的多克隆抗体特异性良好。 利用制备的anti-EoRab43多克隆抗体,对EoRab43蛋白在八肋游仆虫细胞内进行免疫荧光定位,初步结果显示EoRab43主要分布于游仆虫细胞内大核染色体周围的细胞质中,并且主要集中于“弓状”大核内侧的区域,表明该蛋白可能参与膜泡从内质网向高尔基体的转运。