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背景:严重烧伤是一种高死亡率的疾病,严重烧伤后早期出现的休克是引起患者死亡的主要原因,亦是治疗的重点和难点,但目前引起严重烧伤早期休克的病理机制仍未被完全阐明。有报道显示中性粒细胞分泌的肝素结合蛋白（heparin binding protein,HBP）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）可能分别与血管渗漏和糖萼损伤有关,但在严重烧伤中的作用机制不明。目的:研究中性粒细胞脱颗粒产生的HBP和MPO对严重烧伤早期休克的协同诱导作用及具体机制,为严重烧伤休克的治疗提供新思路。方法:本研究分为临床观察、体外实验和动物实验三部分。临床观察部分,采用ELISA检测严重烧伤早期血浆颗粒蛋白（HBP、MPO、MMP9、NE）和糖萼损伤相关分子（HA、HS、SDC-1）的表达;琼脂糖趋化实验检测中性粒细胞趋化功能;流式细胞术检测中性粒细胞活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）表达和细胞凋亡;全自动血细胞仪对中性粒细胞数量进行检测;蛋白质定量组学检测健康志愿者和严重烧伤患者血浆蛋白质表达差异并进行聚类分析。体外实验部分,采用单层内皮细胞通透性实验筛选引起血管内皮通透性增加的免疫细胞和蛋白;RT-PCR检测r HBP刺激HMEC-1细胞后Caspase-3等凋亡相关分子;免疫荧光检测短暂热刺激后中性粒细胞CD35、CD63分子表达和胞质内ROS、次氯酸（hypochlorous acid,HOCL）表达;流式细胞术检测不同重组蛋白和抑制剂干预HMEC-1细胞后CD44分子的表达;免疫荧光检测HOCL等不同刺激条件下HMEC-1细胞的CD44分子胞内结构域（intracellular domain,ICD）和胞外结构域（extracellular domain,ECD）的表达;RT-PCR检测r MPO干预HMEC-1细胞后CD44 m RNA表达。动物实验部分,采用100℃沸水烫伤10s的方式制备20%TBSA III度烧伤小鼠,HE染色观察烧伤组和假伤组小鼠肺、脾等主要脏器水肿;伊文斯蓝染色和湿干比法检测烧伤组和假伤组小鼠肺脏水肿;通过小鼠活体血管成像技术,尾静脉注射r HBP和/或抑肽酶,观察小鼠血管渗漏;100℃沸水烫伤13s的方式制备30%TBSA III度烧伤大鼠,透射电镜检测低分子肝素（LMWH）和甲基强的松龙（MP）对烧伤后大鼠血管糖萼的作用,ELISA检测大鼠血浆HA、HS和SDC-1表达;激光共聚焦显微镜观察HOCL干预后小鼠血管内皮CD44分子表达、中性粒细胞黏附和血管渗漏;小鼠活体血管成像技术观察联合使用r HBP和r MPO诱导的血管渗漏;透射电镜检测MPO抑制剂干预烧伤组和假伤组等小鼠糖萼厚度;伊文斯蓝染色法检测联合使用HBP和MPO抑制剂干预烧伤组、假伤组等小鼠肺脏血管渗漏。结果:临床观察的数据显示,严重烧伤组较健康对照组的中性粒细胞百分比升高（84.1±5.3%,58±3.7%,P＜0.0001）、趋化距离缩短（1161.8±266.1μm,2103.5±171.7μm,P＜0.0001）、凋亡比例下降（19.9±11.1%,60.3±7.8%,P＜0.0001）、胞质ROS表达下降（636±204.8.8a.u.,1376.2±121.8a.u.,P＜0.0001）。严重烧伤组较健康对照组中性粒细胞相关的颗粒蛋白HBP（539.1±206.5ng/m L,63.7±14ng/m L,P＜0.0001）、MPO（622.4±380.3ng/m L,350.3±20.2ng/m L,P＜0.05）、NE（302.9±157.9ng/m L,49.7±13ng/m L,P＜0.0001）、MMP-9（518.1±197.1ng/m L,298.9±25.5ng/m L,P＜0.001）表达显著增加。严重烧伤组较健康对照组糖萼损伤相关分子HA（20.27±2.99ng/m L,5.41±1.19ng/m L,P＜0.0001）、HS（91.6±17.4ng/m L,17.68±3.63ng/m L,P＜0.0001）、SDC-1（11.98±2.58ng/m L,5.07±0.81ng/m L,P＜0.0001）表达显著增加。蛋白定量组学显示严重烧伤早期患者外周血CD44、ICAM-1分子表达较健康志愿者显著增加（P＜0.001,P＜0.0001）。体外实验的数据显示,健康志愿者中性粒细胞与HMEC-1共孵育后,与未处理对照组相比,HMEC-1单层细胞通透性增加（7.67±0.66ng/m L,4.97±0.31ng/m L,P＜0.01）,严重烧伤患者中性粒细胞与HMEC-1共孵育后,与未处理对照组相比,HMEC-1单层细胞通透性增加更显著（14.17±1.65ng/m L,7.67±0.66ng/m L,P＜0.0001）。r HBP组与对照组相比,HMEC-1单层细胞通透性显著增加（15.8±1.64ng/m L,4.69±0.77ng/m L,P＜0.001）,r HBP+抑肽酶组（9.32±2.56ng/m L）与r HBP组（15.8±1.64ng/m L）相比,单层内皮细胞通透性显著下降（P＜0.05）,r HBP+抑肽酶组与对照组相比无显著差异（P=0.072）。免疫荧光数据显示短暂热刺激可诱导中性粒细胞胞膜CD35、CD63表达增加、胞质ROS、HOCL表达增加。HOCL干预组与对照组相比,HMEC-1细胞CD44表达显著降低（12.33±0.79%,98±1.15%,P＜0.0001）,免疫荧光数据显示HOCL诱导HMEC-1细胞CD44分子胞外结构域脱落,对CD44分子胞内结构域无显著影响。r MPO处理HMEC-1细胞后,在4小时、8小时、24小时、48小时与对照组相比,进行性的显著下调HMEC-1细胞CD44 m RNA表达（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.001）。动物实验的数据显示,烧伤组小鼠肺脏HE染色较假伤组,组织间隙明显增大。活体血管成像的数据显示,r HBP可以显著诱导小鼠活体血管渗漏,这种r HBP的诱导作用可被抑肽酶显著抑制。伊文斯蓝染色结果显示,r HBP组（124.46±6.01μg/m L）肺脏伊文斯蓝浓度较对照组（64.61±2.16μg/m L）显著增加（P＜0.0001）,r HBP+20%TBSA组（158.64±20.6μg/m L）较对照组（64.61±2.16μg/m L）显著增加（P＜0.0001）,r HBP+20%TBSA组（158.64±20.6μg/m L）较20%TBSA组（114.4±13.06μg/m L）或r HBP组（124.46±6.01μg/m L）显著增加（P＜0.0001,P＜0.001）;r HBP+抑肽酶+20%TBSA组（98.37±7.76μg/m L）较r HBP+20%TBSA组（158.64±20.6μg/m L）肺脏伊文斯蓝浓度显著减少（P＜0.0001）;抑肽酶+20%TBSA组（78.08±2.14μg/m L）较20%TBSA组（114.4±13.06μg/m L）无显著差异（P=0.0614）。透射电镜结果显示,LMWH和MP可以拮抗烧伤对大鼠血管糖萼的损伤。小鼠活体血管成像和扫描电镜的数据显示,HOCL下调小鼠血管内皮细胞表面CD44表达、诱导中性粒细胞在血管壁黏附增加、加重烧伤后的血管渗漏;分别使用r HBP或r MPO均可诱导小鼠活体血管渗漏,r HBP的诱导作用较r MPO作用显著,联合使用r HBP和r MPO能更快、更显著的诱导小鼠血管渗漏;透射电镜的数据还显示,使用MPO抑制剂AZD5904可显著拮抗烧伤对小鼠血管糖萼的损伤,伤后4小时,AZD5904+烧伤组（250.3±23.1nm）与烧伤组（221.7±8.5nm）比较,糖萼厚度无显著差异（P=0.8005）;伤后24小时,AZD5904+烧伤组（228.3±14.5nm）与烧伤组（75.7±16.3nm）比较,糖萼明显更厚（P＜0.001）,AZD5904+烧伤组（228.3±14.5nm）与假伤组（325.3±21.5nm）比较,糖萼厚度无显著差异（P=0.0551）。联合使用HBP抑制剂抑肽酶和MPO抑制剂AZD5904干预烧伤小鼠,伊文斯蓝染色数据显示,烧伤-r HBP组（158.93±15.96μg/m L）小鼠肺伊文斯蓝的含量较假伤组（57.96±3.28μg/m L）显著增加（P＜0.0001）,烧伤-r HBP+联合抑制剂组小鼠肺伊文斯蓝的含量（106.47±10.02μg/m L）较烧伤-r HBP组（158.93±15.96μg/m L）显著降低（P＜0.001）,但较假伤组（57.96±3.28μg/m L）显著增加（P＜0.001）,假伤组（57.96±3.28μg/m L）和假伤+联合抑制剂组（70.91±7.9μg/m L）小鼠肺伊文斯蓝的含量无显著差异（P=0.1058）。结论:本研究发现在严重烧伤早期,中性粒细胞脱颗粒分泌的HBP和MPO可以协同作用诱导血管渗漏。HBP作用于血管内皮细胞,显著增加血管内皮通透性,MPO催化产物HOCL诱导血管内皮细胞CD44分子脱落进而损伤糖萼,糖萼损伤后中性粒细胞与血管内皮细胞黏附增加,进一步触发中性粒细胞释放HBP持续增加血管内皮通透性,二者协同作用诱导血管渗漏。本研究揭示了严重烧伤早期HBP和MPO协同作用诱导血管渗漏的具体机制,这将为严重烧伤早期休克的治疗提供新的思路。