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目的慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）作为一种常见病以及多发病,具有较高的死亡率,会对人类健康带来重大威胁,而且患者在治疗过程中需要承受严重经济负担,目前已经是受到社会普遍关注的公共卫生问题。然而当前在临床治疗方面仅限于缓解症状,尚无方法完全逆转疾病发展和恶化,因此迫切需要寻找新的有效方法解决这一难题。现有研究表明间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有修复受损组织的能力。相比其它来源的MSCs,脐带来源的MSCs（human umbilical cords mesenchymal stem cell,hUC-MSCs）具有很多临床应用优势。但目前在COPD和肺气肿领域研究较多的是骨髓来源的MSCs,对hUC-MSCs研究甚少。现有观点认为,MSCs主要通过旁分泌途径发挥作用,因此我们拟探索hUC-MSCs及其外泌体在COPD和肺气肿中的作用和机制,有利于为疾病治疗寻找新的思路。方法第一部分:hUC-MSCs及其外泌体的获取和鉴定（1）获取的新鲜脐带立即采用组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs,在显微镜下针对其形态进行观察,并以流式细胞术完成其表面标记的鉴定,体外成骨分化和成脂分化实验鉴定其多向分化潜能;（2）提取hUC-MSCs外泌体,透射电子显微镜观察其形态特征,纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）对其粒径大小进行分析,基于Western blot检测外泌体的表面标志CD63和HSP70。第二部分:hUC-MSCs对SU5416肺气肿作用的实验研究（1）SU5416所致肺气肿建模成功后,尾静脉注射hUC-MSCs,2周后观察疗效。HE染色评价hUC-MSCs对肺气肿的治疗效果;（2）通过ELISA以及western blot分别检测肺泡灌洗液和肺组织VEGF表达变化,TUNEL和western blot分别检测肺组织凋亡水平和活性caspase-3表达水平,western blot检测凋亡相关蛋白BAX和Bcl2;（3）western blot检测肺组织VEGF、p-VEGFR2、VEGFR2、p-AKT、AKT评估VEGF信号通路变化;（4）使用SU5416处理内皮细胞,体外观察SU5416对内皮细胞的作用;（5）使用SU5416处理内皮细胞,hUC-MSCs与内皮细胞共培养,观察hUC-MSCs对内皮细胞的影响,检测共培养上清中VEGF含量;（6）western blot检测共培养内皮细胞Bcl2、BAX、caspase-3评价其凋亡状态,检测VEGF、p-VEGFR2、VEGFR2、p-AKT、AKT评估VEGF信号通路变化。第三部分:hUC-MSCs及其外泌体对木瓜蛋白酶所致肺气肿的作用研究（1）采用木瓜蛋白酶气管内滴注建立大鼠肺气肿模型,HE染色和平均内衬间隔（mean linear intercept,MLI）分析评价建模是否成功;（2）建模成功后,通过尾静脉注射hUC-MSCs及其外泌体,采用不同的时间和剂量分组评价治疗效果差异。HE染色和MLI评价hUC-MSCs及其外泌体对肺气肿的治疗效果。（3）ELISA和western blot分别检测支气管肺泡灌洗液和肺组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的变化;（4）活体成像观察荧光标记的外泌体是否可到达肺部,显微镜下荧光成像观察hUC-MSCs外泌体被肺上皮细胞和内皮细胞摄取情况;（5）高通量测序分析hUC-MSCs外泌体修复木瓜蛋白酶肺气肿的可能下游通路;（6）TUNEL检测肺组织凋亡水平,western blot检测肺组织VEGF、pVEGFR2、VEGFR2、p-AKT、AKT、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK评估凋亡相关信号通路变化。结果第一部分:hUC-MSCs及其外泌体的成功获取和鉴定（1）显微镜下可见hUC-MSCs呈成纤维细胞样,旋涡状生长。流式细胞术分析发现,CD29、CD44、CD73、CD90四个阳性标志均为高表达,四个阴性标志CD19、CD11b、CD34、CD45表达为阴性且阳性率均＜1%;体外成骨分化和成脂分化实验显示hUC-MSCs具有向成骨和成脂分化的潜能,符合MSCs的一般特征;（2）通过透射电镜结果发现,外泌体具有典型的的圆形或者是椭圆形杯状结构特征;基于NTA结果可知,外泌体平均直径是134.5 nm,而western blot检测结果则显示外泌体表达标志蛋白CD63、HSP70,与外泌体的一般特征相符。第二部分:hUC-MSCs修复SU5416所致肺气肿损伤（1）HE染色显示hUC-MSCs明显修复了SU5416所致的肺气肿;（2）相比SU5416组,治疗组肺组织凋亡水平和active caspase-3表达水平明显降低,促凋亡蛋白BAX表达减少,抗凋亡蛋白Bcl2表达升高;（3）相比SU5416组,hUC-MSCs治疗组肺组织VEGF、p-VEGFR2、pAKT蛋白表达明显升高;（4）SU5416可造成内皮细胞死亡呈剂量依赖性;（5）使用SU5416处理内皮细胞,hUC-MSCs与内皮细胞共培养,内皮细胞死亡率下降,共培养上清中VEGF含量明显增高;（6）hUC-MSCs共培养内皮细胞Bcl2明显升高,BAX和活性caspase-3显著降低;（7）hUC-MSCs共培养内皮细胞VEGF、p-VEGFR2、p-AKT显著上调。第三部分:hUC-MSCs及其外泌体修复木瓜蛋白酶所致肺气肿（1）在气管内滴注木瓜蛋白酶构建了典型的木瓜蛋白酶肺气肿模型;（2）HE染色和MLI结果均显示,hUC-MSCs及其外泌体均有效修复了木瓜蛋白酶所致肺气肿。hUC-MSCs作用1周的效果好于2周,200μg外泌体的效果好于400μg;（3）ELISA和western blot分析结果显示,和木瓜蛋白酶组相比,hUCMSCs及外泌体组肺泡灌洗液和肺组织中炎性细胞因子表达明显降低;（4）活体成像显示荧光标记的外泌体可到达肺部,荧光成像观察hUCMSCs外泌体能被上皮细胞和内皮细胞摄取;（5）高通量测序分析显示hUC-MSCs外泌体处理后受到高度调节的通路主要涉及免疫系统、PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路;（6）TUNEL分析显示木瓜蛋白酶组肺组织凋亡水平明显升高,内皮细胞和其他类型细胞凋亡增加,hUC-MSCs外泌体治疗降低了肺组织凋亡程度,内皮细胞和其他类型细胞凋亡明显减少,活性caspase-3表达水平明显降低;（7）相比木瓜蛋白酶组,hUC-MSCs外泌体治疗活化了肺组织VEGFVEGFR2介导的AKT通路和MAPK/ERK通路,hUC-MSCs外泌体含有VEGF、p-AKT、p-MEK、p-ERK活性蛋白。结论（1）hUC-MSCs可显著修复SU5416导致的肺气肿损伤,上调VEGFVEGFR2-AKT通路信号并对抗细胞凋亡;（2）hUC-MSCs及其外泌体可有效修复木瓜蛋白酶导致的肺气肿损伤,二者均有明显的免疫调节作用;（3）hUCMSCs外泌体活化VEGF-VEGFR2介导的AKT通路和MAPK/ERK通路抑制细胞凋亡,从而修复木瓜蛋白酶导致的肺气肿。