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副猪嗜血杆菌病是目前严重威胁猪场的重要细菌性疾病,副猪嗜血杆菌的唾液酸酶与细菌的黏附、毒力和刺激宿主产生抗体有关,而其与宿主免疫细胞相互作用以及调节炎症反应的机制尚不清楚。Siglecs(唾液酸结合免疫球蛋白凝集素)作为免疫细胞表面结合唾液酸的受体,可以与宿主细胞表面或者病原微生物表面的唾液酸配体结合而发挥作用。本课题通过构建副猪嗜血杆菌唾液酸酶基因突变株以及表达Nan H重组蛋白,通过细胞水平的研究探索了副猪嗜血杆菌唾液酸酶是否通过干扰宿主的唾液酸受体(Siglecs)和配体的相互作用从而调节宿主的炎症反应。经研究发现副猪嗜血杆菌唾液酸酶通过改变细胞表面上的Siglecs受体的作用并由MAPK和NF-κB通路介导了炎症反应,为揭示副猪嗜血杆菌的致病机制提供了一定理论依据。主要研究结果如下。1.Δnan H::kan突变株及r Nan H蛋白的表型研究通过自然转化及电转化的方法构建出Δnan H::kan缺失株及Δnan H+p Nan H互补株,原核表达Nan H重组蛋白。生长曲线结果显示,野生株的生长显著快于缺失株和互补株,革兰氏染色显示野生株以单个、短杆状的形态呈现,缺失株则有一部分是成团的存在,而互补菌株则表现为长长的杆状菌。另外发现缺失株的唾液酸酶活性显著降低(P<0.0001),互补株的唾液酸酶活性显著高于缺失株(P<0.001),而不同浓度r Nan H(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)的唾液酸酶活性随着蛋白浓度的增加呈现递增的趋势。2.副猪嗜血杆菌唾液酸酶使3D4/21细胞表面去唾液酸化使用JS0135野生株、Δnan H::kan菌株及Δnan H+p Nan H互补株以MOI为10与3D4/21细胞进行互作6h,流式细胞仪检测显示,野生株和互补株均可以使3D4/21细胞表面去唾液酸化,而缺失株不能。选择不同浓度的r Nan H(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)刺激3D4/21细胞3h,相同的方法检测显示细胞表面的去唾液酸化程度出现剂量依赖性的效应。3.副猪嗜血杆菌唾液酸酶影响了3D4/21细胞中Siglecs的表达通过将JS0135菌株和Δnan H::kan菌株感染3D4/21细胞0.5h,6h,12h和24h,RT-PCR检测文献报道猪中存在的Siglecs。其在转录水平上的结果为Siglec-3和Siglec-10下调,Siglec-5和Siglec-14上调。其中对Siglec-5进行了蛋白水平上的检测,Western Blot结果显示,随着感染时间的延长,Siglec-5的表达量增加,而Siglec-10的表达量降低,其趋势和转录水平上的结果一致。4.副猪嗜血杆菌唾液酸酶诱导炎性细胞因子的产生使用JS0135、Δnan H::kan和Δnan H+p Nan H菌株感染3D4/21细胞,结果显示促炎性细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α的表达量在野生株和互补株感染期间显著高于缺失株感染,而抑炎性细胞因子IL-10的表达量显著低于缺失株。选择使用r Nan H进行后续试验,以相同的方法与3D4/21细胞互作,结果为促炎性细胞因子的上调和抑炎性细胞因子的下调都呈现剂量和时间依赖性。检测炎性细胞因子在蛋白水平上的变化,Western Blot结果显示在蛋白与细胞互作3h时,随着蛋白浓度的提高,IL-1α、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α的表达量增加,而IL-10的表达量降低。5.副猪嗜血杆菌唾液酸酶通过调节Siglec-5激活了炎性信号通路将不同浓度的r Nan H蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)刺激3D4/21细胞3h,然后Co-IP检测Siglec-5是否与SHP2发生互作。结果显示,随着蛋白浓度的增加,SHP2与Siglec-5的结合量逐渐减少。随后我们检测了和炎症反应相关的炎性信号通路MAPK和NFκB,结果显示MAPK通路中的ERK磷酸化程度随着蛋白浓度的增加而增强,IκBα的降解程度也增加。