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目的以针刺足三里对佐剂性关节炎大鼠镇痛效应为研究平台,验证针刺激活穴区NF-κB信号通路,明确NF-κB信号通路的表达细胞类型,并进一步探讨NF-κB信号通路介导针刺镇痛的神经生物学机制,为阐释针刺镇痛效应的穴位初始调控机制提供实验依据。方法以足底热辐射痛阈值作为效应指标观察针刺“足三里”穴对正常大鼠与佐剂性关节炎大鼠的镇痛作用,采用免疫组化及Western Blot技术检测磷酸化的P50(P-P50)及P65(P-P65)在细胞核内的表达,以验证针刺是否激活穴位局部的NF-κB信号通路;采用免疫荧光共染观察穴位局部NF-κB信号通路的表达细胞类型;在此基础上探究穴位局部NF-κB信号通路介导针刺镇痛的上下游作用机制:在穴位局部注射HMGB1中和抗体,采用WB技术检测HMGB1、TLR2、TLR4、Myd88、P-P65的变化来观察注射HMGB1中和抗体后对穴位局部HMGB1-NF-κB信号通路的影响,探究NF-κB信号通路的上游信号分子;在穴位局部注射NF-κB抑制剂,观察其对镇痛效应的影响,并采用放射免疫技术检测脊髓部位脑啡肽、强啡肽、β-内啡肽的含量变化、ELISA技术检测COX2含量的变化,探究NF-κB信号通路介导针刺镇痛的下游作用机制。结果1.针刺足三里对大鼠热辐射痛阈值的影响针刺第1天即可提高CFA大鼠足底热辐射痛阈值(P<0.05),且效应可持续至针刺第7天(P<0.01)。针刺对正常大鼠足底热辐射痛阈值,仅在第3天有升高(P<0.05),其余观察时间点未见明显影响。2.针刺后对穴位局部NF-κB信号通路的影响针刺后穴位局部组织细胞核内P-P50及P-P65表达增高(P<0.01),表明针刺后激活了穴位局部的NF-κB信号通路。3.NF-κB信号通路的表达细胞类型盐水+针刺组及模型+针刺组核内有大量P-P50、P-P65的表达,且与S100A4标记的成纤维细胞有大量共染,表明针刺后可激活成纤维细胞上的NF-κB信号通路。4.穴区注射HMGB1中和抗体对NF-κB信号通路上游因子的影响穴位局部注射HMGB1中和抗体后,TLR2、TLR4、Myd88有下降的趋势;说明中和穴区HMGB1后HMGB1-TLR-NF-κB信号通路受到部分抑制,HMGB1可能是NF-κB信号通路的上游。5.穴区注射NF-κB抑制剂对大鼠足底热辐射痛阈值的影响与模型组相比,针刺组从第2天开始出现镇痛效果(P<0.05),且持续到第7天(P<0.01);与针刺组相比,针刺+NF-κB抑制剂组从第2天开始出现针效下降(P<0.01),且持续到第7天(P<0.01),针刺镇痛效应被明显抑制。6.穴区注射NF-κB抑制剂对脊髓镇痛物质及致痛因子的影响与模型组相比,针刺后COX2含量下降(P<0.05);阿片肽类物质未见明显变化。穴位局部注射NF-κB抑制剂后与针刺组比有COX2有上升趋势,说明穴位局部NF-κB信号通路介导镇痛效应机制可能与影响脊髓部位COX2的释放有关。结论1.针刺足三里可激活穴位局部NF-κB信号通路,NF-κB信号通路为穴位局部关键信号通路之一。2.针刺足三里可激活穴位局部成纤维细胞上的NF-κB信号通路。3.针刺足三里可激活穴位局部HMGB1-TLR-NF-κB信号通路,HMGBI可能为NF-κB信号通路的上游信号分子之一。4.穴位局部NF-κB信号通路可能通过抑制脊髓部位COX2表达来介导针刺镇痛。