【摘 要】
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种具有诸多益生功能的小分子氨基酸,在食品、医药和饲料等行业已有广泛应用且前景广阔。目前GABA工业生产的低效性、发酵法的便捷性以及乳酸菌公认的安全性,使得乳酸菌发酵法高效生产GABA成为未来发展趋势。本论文首先采用单因素优化策略,通过摇瓶实验强化了短乳杆菌CD0817的GABA发酵工艺参数,随后依据优化的参数,在10 L发酵罐中建
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种具有诸多益生功能的小分子氨基酸,在食品、医药和饲料等行业已有广泛应用且前景广阔。目前GABA工业生产的低效性、发酵法的便捷性以及乳酸菌公认的安全性,使得乳酸菌发酵法高效生产GABA成为未来发展趋势。本论文首先采用单因素优化策略,通过摇瓶实验强化了短乳杆菌CD0817的GABA发酵工艺参数,随后依据优化的参数,在10 L发酵罐中建立小试转化工艺;为进一步探索GABA高产机理,基于自杀质粒构建了gad A的重组敲除质粒,并尝试建立乳酸菌无痕基因敲除方法。本文的主要结果如下:（1）优化培养基和培养条件。利用单因素摇瓶实验筛查关键因子及其最佳水平。在30℃条件下进行,种子培养基配方为（g/L）:葡萄糖10,酵母浸粉FM408 35,谷氨酸钠28,Mn SO4 0.05,吐温-80 1,p H 5.0;发酵培养基配方为（g/L）:葡萄糖5,酵母浸粉FM408 35,Mn SO4 0.05,吐温-801,L-谷氨酸650。结果表明,葡萄糖、酵母浸粉、Mn SO4和吐温-80以及培养温度是短乳杆菌CD0817生产GABA的关键影响因子。（2）在10 L发酵罐中对上述发酵工艺的发酵效果进行验证。将种子菌液按照10%（v/v）的接种量转移至3 L发酵培养基中,培养温度为30℃,搅拌速度为50 rpm。发酵48 h后,GABA产量达到了321.88±6.73 g/L,相对于原始发酵方法提高了27.73%,底物转化率达99.80%。（3）构建了基于自杀质粒p K18mob Sac B的短乳杆菌CD0817谷氨酸脱羧酶基因gad A的重组敲除质粒——p K18＿Cm R＿up&down。此重组质粒含gad A上下游同源臂融合片段（u&d）,用于同短乳杆菌CD0817基因组进行同源重组;氯霉素抗性基因（Cm R）,用作正筛选标记;Sac B基因用于诱发第二次同源重组和进行负筛选。理论上经过与基因组DNA的两次同源重组可实现靶基因gad A的无痕敲除。采用电击转化法在选择性培养基上获得转化子,通过PCR和测序验证并未得到预期片段。仍需更全方面的优化与探索以建立高效稳定的短乳杆菌无痕敲除方法。
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