第一部分RNA基因芯片分析失神经骨骼肌萎缩目的:外周神经损伤是骨科常见病症,神经损伤后靶肌往往会发生难以避免的萎缩,造成患者严重的功能障碍,甚至可能导致死亡。失神经引起的骨骼肌萎缩,伴随着复杂的生化生理变化,因此,临床上仍然缺乏有效的策略来治疗失神经骨骼肌萎缩。而这归根到底是由于我们对调控失神经肌萎缩的具体分子机制还不甚了解。本部分研究将使用cDNA基因芯片（Microarray）对失神经肌肉的全部mRNA进行检测分析,以求寻找失神经肌萎缩相关的调控基因,为阐明失神经肌萎缩具体的分子机制和开发治疗策略奠定基础。方法:在这项研究中,我们研究了大鼠坐骨神经离断后胫前肌的基因转录谱（transcriptional profile）。使用cDNA基因芯片（Microarray）技术筛选出可能参与失神经胫前肌萎缩过程的关键基因。采用Real-time PCR方法检测部分关键基因以确认芯片数据的可靠性。使用生物信息学手段,自组织图（Self-Organizing Feature Map,SOM）,Pearson 相关热图（Pearson correlation heatmap）,主要成分分析（principle component analysis,PCA）等办法分析所得到的基因芯片数据,探究差异表达基因在神经损伤后不同时间点的变化趋势与相互关系。使用基因功能注释数据库KEGG,GO分析,String相互作用分析,网络化、系统化分析失神经胫前肌的转录组基因信息,按照基因功能、蛋白质功能进行分类,推测不同时间段参与失神经肌萎缩调控的关键基因及通路。结果:基因芯片数据分析表明,坐骨神经横断后的胫前肌在不同时间点存在大量差异表达基因,其中最早的差异表达基因发生在损伤后15min,之后随时间变化而逐渐升高,14d时间点是差异表达基因最多的时间点。根据自组织图（SOM）,Pearson相关热图,主成分分析（PCA）,可将失神经后胫前肌基因表达谱分为四个不同的转录阶段。根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）分析可将四个转录阶段分别被称为“氧化应激阶段”,“炎症反应阶段”,“肌肉萎缩阶段”和“肌萎缩纤维化阶段”。更重要的是,我们发现失神经后24h时间点可能是启动失神经胫前肌萎缩的触发点（trigger）。进一步分析发现,24 h时间点的差异表达基因主要与炎症反应有关,据此我们筛选出了一些可能是启动失神经肌肉萎缩的触发基因。总体而言,该部分研究对失神经引起的肌肉萎缩作了全景式的研究,找到了一些可能是失神经肌萎缩的重要调控机制,为接下来的研究奠定了基础。结论:本研究发现,靶肌在失神经支配后将发生多种病理生理变化。肌肉在萎缩发生早期存在一个较为明显的氧化应激增强的过程以及炎症反应失控过程,这两者可能是导致肌肉蛋白质大量水解、肌肉萎缩的主要原因。除此之外,本实验发现了调控失神经肌萎缩的一个关键时间点24h,这个时间点基因发生的变化和免疫及炎症反应高度相关,我们认为炎症反应可能是失神经肌萎缩的一个关键触发因子,我们将在后续的研究中进一步研究炎症反应是如何影响肌萎缩的。第二部分 IL-6/JAK/STAT3信号通路调控失神经骨骼肌萎缩目的:骨科临床治疗中常见各种神经损伤,神经损伤后因其难以修复常常导致效应器官严重的功能缺失。一旦支配运动的神经受损,靶肌往往会发生难以避免的萎缩,造成患者严重的功能障碍。因此,临床上一直在努力寻找防治失神经肌萎缩的有效手段。但到目前为止,尚未完全阐明失神经肌萎缩具体的分子机制。而事实上,只有深入了解失神经肌萎缩的详细分子机制后才能进一步开发针对肌萎缩的分子靶向治疗,才能寻找到延缓肌肉质量丢失的办法。本研究将根据前期的基因芯片结果,寻找可能调控失神经肌萎缩的相关基因,并通过体内体外实验,探讨这些筛选出的基因的实际调控作用,并在此基础上寻找失神经肌萎缩有效的治疗办法。方法:根据基因芯片结果筛选出可能参与失神经骨骼肌萎缩的关键基因,采用Real-time PCR方法检测这些关键基因在失神经后随时间的变化,通过免疫荧光技术确定关键蛋白pSTAT3的表达及定位。在体外尝试使用rIL-6构建C2C12肌管萎缩模型。在体内,使用rIL-6模拟失神经肌萎缩过程中持续高表达的IL-6,同时检测IL-6r抗体tocilizumab在体内失神经模型中的抗肌萎缩效果。借助rIL-6在体外构建的C2C12肌管萎缩模型,检测JAK抑制剂ruxolitinib的抗肌萎缩效果,以及STAT3抑制剂C188-9的抗肌萎缩效果。检测ruxolitinib和C188-9在体内失神经胫前肌萎缩过程中的保护作用。最后检测慢病毒体内敲低STAT3是否可以在失神经胫前肌萎缩过程中发挥保护作用。使用透射电子显微镜（TEM）观察失神经胫前肌中的线粒体的变化、自噬小体形成以及肌小节的排列。通过免疫荧光技术确定失神经胫前肌快肌纤维和慢肌纤维的数量,推断快慢肌转变的过程。使用Western Blot对自噬以及泛素化蛋白水解的相关蛋白进行检测,确定关键基因对失神经肌萎缩的调控机理。结果:差异表达基因的基因芯片分析表明,24h是一个失神经肌萎缩的关键时间点,在该时间点炎症相关的基因被明显触发,结合IPA（Ingenuity Pathway Analysis）等生信分析构建炎症相关基因的级联调控分析图,发现IL-6/JAK/STAT3信号通路被强烈激活。在体外实验中,我们发现高水平的rIL-6通过激活JAK/STAT3诱导C2C12肌管萎缩,同时,ruxolitinib（一种JAK1/2抑制剂）或C188-9（一种STAT3抑制剂）均能通过抑制JAK/STAT3途径,显著减轻rIL-6诱导的C2C12肌管萎缩。在体外实验中,使用tocilizumab（抗IL-6r的抗体）药理阻断IL-6与IL-6r结合,或者使用ruxolitinib/C188-9（JAK/STAT3抑制剂）阻断IL-6下游信号转导均可以减缓失神经引起的胫前肌萎缩。不仅如此,慢病毒介导的STAT3-siRNA也能发挥与上述药物相似的对抗肌萎缩的作用。通过透射电镜分析发现敲低STAT3基因表达对失神经的骨骼肌线粒体功能具有显著改善作用,萎缩基因（MuRF1和MAFbx）和自噬相关基因（PINK1,BNIP3,Beclin1,ATG7和LC3B）的表达均呈现不同程度的降低。最后,对失神经胫前肌的肌纤维类型分析发现,STAT3基因可能发挥着调控肌纤维类型转变的作用。结论:经典炎症信号通路IL-6/JAK/STAT3可能是失神经引起的骨骼肌萎缩的主要调控轴,STAT3处于调控网络的关键节点,抑制IL-6/JAK/STAT3通路,亦或针对关键调控基因STAT3开发的靶向基因治疗可能是对抗失神经骨骼肌萎缩的有效治疗策略。第三部分 阿司匹林通过抑制炎症减轻失神经引起的骨骼肌萎缩目的:失神经肌萎缩一旦发生很难治愈,寻找缓解肌萎缩进程的方案不失为一种有效的治疗思路。根据本文前两部分的研究,我们基本确定了失神经肌肉中,早期失控的炎症反应是肌萎缩的重要诱因,其中IL-6/JAK/STAT3信号通路可能是失神经肌萎缩的一条主要调控轴。因此,抗炎药物可能具有治疗失神经肌萎缩的作用。考虑到经典的非甾体类抗炎药物阿司匹林具有抗多种炎症因子的作用,因此在本部分研究中,我们将探索阿司匹林对于失神经支配的骨骼肌是否具有保护作用。方法:构建小鼠失神经肌萎缩的模型,观察腹腔注射阿斯匹林悬浊液20 mg/kg/d的抗肌萎缩效果。使用qRT-PCR方法以及ELISA方法对一些常见的炎症因子进行了检测,以确定阿司匹林的抗炎作用。使用Western Blot以及免疫荧光染色检测阿司匹林是否可以抑制肌肉中失神经所激活的IL-6/JAK/STAT3信号通路。通过Western Blot以及免疫荧光染色确定失神经胫前肌中快肌纤维和慢肌纤维的数量,推断快慢肌转变的过程,进一步探索阿司匹林的抗肌萎缩机制。结果:小鼠腹腔注射阿司匹林悬浊液（20 mg/kg/d）可有效缓解坐骨神经离断引起的胫前肌萎缩,小鼠胫前肌的湿重比和肌肉平均横截面积都较对照组得到了十分显著的提高。Western Blot检测结果显示阿司匹林降低了胫前肌中肌肉特异性E3泛素连接酶MuRF-1和MAFbx的表达。qRT-PCR方法检测发现阿司匹林能较好地抑制IL-6和IL-1β这两种促炎细胞因子的mRNA表达。ELISA检测结果显示阿司匹林能较好地抑制IL-6,IL-1β和TNF-α这三种促炎细胞因子的蛋白质表达。Western Blot以及免疫荧光染色结果显示阿司匹林能显著抑制肌肉中失神经所激活的IL-6/JAK/STAT3信号通路。最后,Western Blot以及免疫荧光染色显示阿司匹林可提高失神经肌肉中sirt1和PGC-1α的表达,同时可抑制慢肌纤维向快肌纤维转变的过程。结论:综上所述,本研究首次发现了阿司匹林对失神经肌萎缩的保护作用,并且至少部分的保护作用是通过抑制IL-6/JAK/STAT3信号通路实现的。这项研究拓展了经典抗炎药物阿司匹林的药理功能和临床适应症,同时也为失神经肌萎缩的防治提供了新的治疗策略。