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第一部分PD-L1通过Gas6/MerTK信号通路促进非小细胞肺癌细胞增殖研究目的:程序性死亡配体-1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）主要作为负性免疫检查点介导肿瘤免疫逃逸促进肿瘤发生发展。近年来,以PD-L1或者程序性死亡因子1（programmed cell death 1,PD-1）为靶点的免疫治疗在晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治疗中取得了较好的临床效果,但是一线治疗只有20%-30%病人从中获益。此外,即使有些患者PD-L1高表达,依然不能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益。因此我们迫切需要探索导致免疫治疗效果差异的原因及潜在机制。后续越来越多的研究还证实了 PD-L1分子可不依赖受体PD-1,通过激活肿瘤内源性信号通路从而介导肿瘤细胞的增殖、转移和耐药等生物学过程,但是涉及的信号传导通路及机制尚不明确。本部分实验主要探讨除传统免疫负性调控外,肿瘤细胞表达的PD-L1通过Gas6/MerTK通路影响NSCLC细胞增殖的作用及机制研究。研究方法:1.通过慢病毒载体构建PD-L1稳定敲弱和过表达的NSCLC细胞株;利用qRT-PCR和Western blot实验对稳转细胞株中PD-L1的表达进行检测;利用CCK-8、克隆形成和EdU实验检测干预PD-L1表达细胞增殖能力的变化;2.络氨酸激酶受体蛋白芯片检测干预PD-L1表达后相关蛋白激酶的表达变化;利用Western blot检测干预PD-L1表达后,NSCLC细胞株中MerTK及下游AKT、Erk信号通路及下游蛋白的变化;利用Western blot和免疫组织化学方法检测NSCLC组织及癌旁组织中PD-L1与p-MerTK表达水平,并进行相关性分析;3.利用流式细胞术检测PD-L1过表达细胞株中加入UNC2025后细胞周期和凋亡变化;利用Western blot检测瞬时干扰MerTK,加入UNC2025/LDC1267及外源性Gas6刺激后MerTK及其下游信号通路的变化;4.构建裸鼠皮下成瘤模型体内验证PD-L1介导肿瘤细胞增殖的作用及机制。研究结果:1.干扰或过表达PD-L1分子后,PD-L1在mRNA和蛋白水平表达均显著下调或上调;干扰PD-L1分子可以抑制NSCLC细胞株的增殖;过表达PD-L1分子可以促进NSCLC细胞株的增殖;2.受体络氨酸激酶蛋白芯片结果发现干扰PD-L1表达后p-MerTK表达明显下调;干预PD-L1表达影响了 MerTK及AKT和Erk信号通路的活化,同时下游的Cyclin D1和Bcl-2也发生了改变;.NSCLC组织中,PD-L1表达与p-MerTK表达成正相关;3.过表达PD-L1可以降低UNC2025阻断导致的G0/G1期、S期细胞比例减少和G2/M期细胞比例增多;过表达PD-L1可以抑制UNC2025引起的凋亡细胞比例增多;过表达 PD-L1 可以抑制 UNC2025 或 si-MerTK 引起的 p-MerTK、p-AKT、P-Erk、Cyclin D1和Bcl-2的下调,但是总蛋白MerTK、AKT、Erk保持不变;4.PD-L1过表达可以显著削弱UNC2025在裸鼠体内对肿瘤大小的抑制作用。研究小结:PD-L1分子可以通过活化MerTK及其下游的AKT及Erk信号通路来调节周期相关蛋白Cyclin D1和凋亡相关蛋白Bcl-2来介导NSCLC细胞株的增殖。第二部分核PD-L1协同Sp1增加Gas6分泌激活MerTK信号通路促进非小细胞肺癌细胞增殖研究目的:前部分研究已经证实PD-L1分子可以通过活化MerTK及其下游的AKT/Erk信号通路介导NSCLC细胞的增殖,但是PD-L1如何影响MerTK的活化继而影响下游信号通路的激活尚不清楚。MerTK活化的主要方式是通过与其配体生长停滞特异性基因 6（growth arrest-specific gene 6,Gas6）和蛋白 S1（protein S1,PROS 1）结合。但是在NSCLC中,PD-L1是否通过影响其配体表达来活化MerTK信号通路介导肿瘤细胞增殖还未见报道。因此本部分实验旨在探讨PD-L1如何活化MerTK信号通路及潜在的机制。研究方法:1.利用qRT-PCR和ELISA方法检测PD-L1对Gas6和PROS1表达及分泌的影响;2.利用蛋白质核质分离,免疫荧光和瞬时转染实验技术检测NSCLC组织和细胞株中核PD-L1的表达;同时检测PD-L1过表达后核PD-L1的表达变化;3.利用蛋白质谱分析检测与PD-L1存在相互作用的蛋白,并通过蛋白质免疫共沉淀方法进行验证;利用免疫荧光,蛋白质核质分离技术检测干扰KPNB1分子表达后核PD-L1的表达变化;4.构建含有Gas6基因不同启动子区段的荧光素酶报告载体,检测PD-L1过表达对Gas6基因转录活性的影响;构建含有转录因子Sp1潜在结合位点及突变位点的重组质粒,明确PD-L1增强Gas6基因启动子活性的Sp1结合位点;5.染色质免疫共沉淀验证PD-L1、Sp1能否分别与Gas6基因启动子区结合;qRT-PCR和Western blot检测干预Sp1表达后Gas6的mRNA和蛋白变化;利用双荧光素酶报告载体检测共转PD-L1过表达质粒和Sp1过表达质粒对Gas6启动子区的活性影响;利用蛋白质免疫共沉淀、qRT-PCR和Western blot检测PD-L1对Sp1表达的影响;6.利用EdU和Western blot技术检测Gas6/MerTK信号通路激活对NSCLC细胞增殖的作用及机制。研究结果:1.PD-L1可以影响Gas6的转录,但对PROS1的表达无影响;PD-L1可以促进Gas6通过外泌体方式分泌至细胞外;2.NSCLC组织和细胞株中存在核PD-L1的表达;过表达PD-L1后,PD-L1进入细胞核增多;3.PD-L1与KPNB1分子存在相互作用;干扰KPNB1表达可以引起核PD-L1表达的变化;4.PD-L1促进Gas6转录活性增强区位于启动子区-1504至-907片段;Gas6基因启动子区-1504至-907片段存在三个Sp1结合位点,第三个位点是主要结合位点;5.PD-L1和Sp1均可被募集结合到Gas6基因启动子上;干扰Sp1的表达可以影响Gas6在mRNA和蛋白的表达水平;PD-L1与Sp1可协同作用促进Gas6的转录;PD-L1与Sp1分子存在相互作用,且干扰PD-L1可以影响Sp1表达;6.Gas6/MerTK信号通路激活可促进NSCLC细胞株的增殖。研究小结:在NSCLC组织和细胞中均存在核PD-L1的表达,且KPNB1分子介导PD-L1发生核转位。PD-L1分子进入细胞核后,与转录因子Sp1协同作用促进Gas6转录及分泌,进而激活MerTK信号通路介导NSCLC细胞增殖。总结:本研究以PD-L1分子为切入点,首先在体内外均证实PD-L1分子可以促进NSCLC细胞的增殖能力。其次,我们发现PD-L1可以通过活化MerTK及其下游的AKT/Erk信号通路调控细胞周期和凋亡影响肿瘤细胞的增殖。最后,我们证实PD-L1分子可以在KPNB1的介导下发生核转位,通过与转录因子Sp1协同作用促进配体Gas6的表达,Gas6分泌至细胞外激活MerTK信号通路,从而介导NSCLC细胞的增殖作用。本研究首次报道了核PD-L1分子在NSCLC增殖中的作用及相关调控机制,为PD-L1免疫治疗联合KPNB1抑制剂或者MerTK抑制剂在NSCLC治疗中的应用提供理论依据和重要思路。