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糜蛋白酶(EC3.4.21.1)属于丝氨酸蛋白酶家族,酶原在Arg15和Ile16之间(按Bovine chymotrypsin A序列编号)被胰蛋白酶切为通过二硫键连接的两部分,随后在Leul3切去短肽Ser14-Arg15,在Tyr146和Asn148切去短肽Tyr147-Asn148,形成由二硫键相连的三条多肽链并具有生物活性。糜蛋白酶能专一性水解蛋白中Tyr, Trp和Phe羧基端肽键,也能水解Leu羧基端肽键。本文成功表达了重组人糜蛋白酶hCT,自降解位点突变体mhCT(F114I)和A链缺失突变体mhCT(A),并对重组hCT自激活进行研究,探讨了三维结构变化对酶分子性质及催化能力的影响。重组hCT最适pH为8.0,最适温度37℃。以BTEE为底物时米氏常数为0.076mmol/L,紫外吸收光谱扫描显示最大紫外吸收在281nm,HPLC鉴定纯度达到96.9%。酶在pH3-6条件下稳定,在最适pH附近不稳定,酶的自切速率此时最快。pH4.0下加入金属离子对酶活影响小,p1H8.0下较为显著。Ca2+添加能稳定酶活。重组糜蛋白酶酶原复性后不用胰蛋白酶激活而是利用酶原本身的微弱活性可以获得活性糜蛋白酶,该方法获得的糜蛋白酶本文中称为自激活hCT。自激活hCT最适pH为5.5-6.5,最适温度50℃,以BTEE为底物时米氏常数为0.12mmol/L。金属离子对酶的影响较大,Fe3+和Cu2+1mmol/L时引起酶失活。将糜蛋白酶A链序列突变为胰蛋白酶的前肽序列获得mhCT(A)突变体,与野生型糜蛋白酶相比,由于新的A链不再通过二硫键与B链连接,所以激活后A链将从蛋白分子上脱离,从而可获得hCT的A链缺失突变体。1mhCT(A)突变体的最适pH值为7.0,突变使糜蛋白酶pH适应范围更广,A链缺失突变降低了糜蛋白酶的温度稳定性。以BTEE为底物时的Km值为0.047mmo1/L。将自切位点114位F突变为I,获得1mhCT(F114I)突变体,该突变体以BTEE为底物时米氏常数为0.078mmol/L,与重组hCT接近。将114位点突变后,糜蛋白酶热稳定性提高,冻融稳定性提高。mhCT(F114I)突变体在pH3-6条件下稳定性较好,25℃温浴24h,突变体在pH9.0下的残余酶活为40%,而重组hCT保留10%。