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原发性高血压是世界范围内最常见慢性病之一,是严重影响人口健康的重大公共卫生问题。高血压病因复杂且会出现多种并发症,如心肌梗塞、冠心病和脑卒中等,药物治疗虽然可减少患者的并发症风险,但目前的药物都是基于30年前所认知的高血压机制所研发的,且在临床应用中呈现出疗效不足和适应症局限的问题。因此,突破高血压现有发病机制的认识,是当前解决高血压预防、控制和治疗困局的前提。高血压发病机制至今尚没有明确定论,在高血压发病机制研究中,血管内皮细胞功能障碍是髙血压的基本病理改变之一,近年来,大量文献表明微小RNA（micro RNAs,miRNAs）可通过影响内皮细胞增殖与迁移、内皮修复、血管生成或炎症分子表达等途径导致血管内皮细胞功能障碍而参与到高血压的发生机制中。因此,发现与高血压相关的特异性miRNAs,研究其与高血压病理过程的关系,将为深入认知高血压的发生、发展提供新视角。目的:本研究拟寻找原发性高血压相关的miRNAs,以期用作高血压的生物标志物;明确miRNAs通过调控靶基因对血管内皮细胞产生的生物学效应,阐明miRNAs在原发性高血压发生发展中的分子调控作用;并在人群水平研究miRNAs及其靶基因与高血压及其临床指标的关系,为高血压的发病机制及靶向治疗提供理论依据。方法:本研究的研究对象来自于2017年吉大一院的住院患者及同期健康体检人群,以及“2012年吉林省成人慢性病及其危险因素调查”项目调研的人群。采用基因芯片技术在6名高血压患者与6名健康人血浆中筛选出差异表达的miRNAs,通过RT-q PCR技术在33名高血压患者与33名健康人群血浆中对差异表达的miRNAs进行验证,并利用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线检测目标miRNA是否可作为高血压的潜在生物标志物。生物信息学Targetscan网站预测目标miRNA的靶基因,String在线数据库对靶基因进行蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络构建,Metascape软件和Cytoscape软件对靶基因进行基因本体论（Gene Ontology,GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析,寻找关键功能模块和关键基因,结合相关文献查阅并根据基因的功能选择靶基因。通过RT-q PCR实验、western-blot实验和荧光素酶报告实验进一步验证靶基因。通过细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡以及管腔形成实验探究miRNA及其靶基因对血管内皮细胞功能的影响。通过营救实验证实miRNA对血管内皮细胞的功能影响是通过调控靶基因而实现。扩大人群样本,通过RT-q PCR和Elisa实验检测135名高血压人群与135名健康人群血清中miRNA以及靶基因的表达水平。通过Spearman相关性分析明确miRNA及其靶基因与高血压相关临床指标的相关性。结果:1.高血压相关miRNA的筛选及验证基因芯片结果显示,在高血压人群与健康人群血浆中存在18个差异表达的miRNAs,其中6个miRNAs（miR-6125,miR-6089,miR-3656,miR-6803-5p,miR-3135b和miR-6068）在高血压人群中上调,12个miRNAs（miR-19b-3p,miR-19a-3p,miR-15a-5p,miR-106b-5p,miR-4306,miR-20b-5p,let-7i-5p,miR-107,miR-20a-5p,miR-185-5p,miR-93-5p和miR-15b-5p）在高血压人群中下调。通过RTq PCR在人群中进一步验证,验证结果与芯片结果一致的3个差异表达的miRNAs为miR-3656,miR-3135b和miR-107,本研究选择高血压人群中表达量最高的miR-3656进行高血压发生机制相关研究。ROC曲线结果显示miR-3656的曲线下面积是0.875,说明miR-3656可作为高血压的潜在诊断性生物标志物。2.miR-3656与血管内皮细胞功能的关系miR-3656 mimics组与对照组相比,对血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力以及管腔形成能力具有抑制作用,对血管内皮细胞的凋亡能力具有促进作用,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;miR-3656 inhibitor组与对照组相比,对血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力以及管腔形成能力具有促进作用,对血管内皮细胞的凋亡能力具有抑制作用,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。3.miR-3656的靶基因预测及验证Targetscan网站预测miR-3656的靶基因1313个,根据提高置信度和特异度的筛选条件将靶基因范围缩小至332个。GO富集分析显示332个靶基因参与的主要生物学过程包括发展过程、多细胞有机体过程、生物调节、局限性定位等;涉及的细胞组分主要包括RNA聚合酶II转录调节复合物和高尔基体膜等;主要的分子功能主要包括DNA结合转录激活活性,RNA聚合酶II特异性、DNA结合转录抑制活性,RNA聚合酶II特异性等。KEGG通路分析显示靶基因主要参与APMK信号通路、胰岛素信号通路、人类巨细胞病毒感染、血管内皮生长因子信号通路等。靶基因的互作网络中存在8个关键功能模块,8个功能模块中包含34个基因,将34个基因与在互作网络中筛选出的前50个关键基因进行对比,结果发现,既包含于关键模块又所属于前50关键基因的基因共21个,查阅与高血压及血管内皮相关基因的文献,选择靶基因内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）和一种具有1型血小板反应蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶13（A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type-1 motif s,member 13,ADAMTS13）。进一步通过实验对靶基因进行验证,RT-q PCR和western blot结果显示转染miR-3656 mimics组的eNOS和ADAMTS13的m RNA及蛋白表达水平与对照组相比均下调,而转染miR-3656inhibitor组的eNOS和ADAMTS13的m RNA及蛋白表达水平与对照组相比均上调,且差异有统计学意义（P＜0.05）。此外,荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-3656 mimics+eNOS 3’UTR组或miR-3656 mimics+ADAMTS13 3’UTR组与其他对照组相比较荧光值最低,且差异有统计学意义（P＜0.05）。4.靶基因与血管内皮细胞功能的关系沉默eNOS或ADAMTS13组与对照组相比,对血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力和管腔形成能力均具有抑制作用,对血管内皮细胞的凋亡能力具有促进作用,且差异均具有统计学意义（P＜0.05）;过表达eNOS或ADAMTS13组与对照组相比,对血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力和管腔形成能力具有促进作用,对血管内皮细胞的凋亡能力具有抑制作用,且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。5.靶基因在miR-3656调控血管内皮细胞功能中的作用营救（rescue）实验结果显示,与对照组相比,miR-3656 mimics对血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力和管腔形成能力具有抑制作用,对血管内皮细胞的凋亡能力具有促进作用,且差异有统计学意义（P＜0.05）;而与miR-3656mimics组比较,miR-3656 mimics+eNOS组和miR-3656 mimics+ADAMTS13组均可以促进血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力和管腔形成能力,而抑制血管内皮细胞的凋亡能力,且差异均具有统计学意义（P＜0.05）,说明eNOS和ADAMTS13均可以营救miR-3656对血管内皮细胞造成的损伤。6.miR-3656、eNOS和ADAMTS13与高血压及其临床指标的关系在135名高血压患者与135名健康对照人群的血清样品中,PCR结果显示miR-3656在高血压人群中高表达,且差异有统计学意义（P＜0.001）。Elisa实验结果显示,eNOS的蛋白表达水平在高血压组低于健康对照组,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。而ADAMTS13的蛋白表达水平在高血压组与在健康对照组差异无统计学意义（P=0.442）。相关性分析结果显示,miR-3656与收缩压（systolic blood pressure,SBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）、高血压等级、甘油三酯（triacylglycerol,TG）以及白细胞介素6（interleukin 6,IL-6）均呈正相关（P＜0.05）,与高敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP）呈负相关（P＜0.05）。eNOS与SBP、DBP以及高血压等级均呈负相关（P＜0.05）。ADAMTS13与肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNFα）呈正相关（P＜0.05）。结论:1.miR-3656在高血压人群中的表达水平高于正常人群。2.miR-3656可以影响血管内皮细胞功能,miR-3656过表达可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,促进凋亡;抑制miR-3656表达可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,抑制凋亡。3.eNOS和ADAMTS13均可以影响血管内皮细胞功能,沉默eNOS或ADAMTS13可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,促进凋亡;过表达eNOS或ADAMTS13可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,抑制凋亡。4.eNOS和ADAMTS13是miR-3656的靶基因,miR-3656可以通过靶向调控eNOS和ADAMTS13调节血管内皮细胞功能。5.miR-3656与收缩压、舒张压、高血压等级、TG以及IL-6均呈正相关;eNOS在高血压人群中低表达并且与收缩压、舒张压以及高血压等级均呈负相关。