过氧化氢酶体激活增殖受体(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是配体活化的核转录因子。研究表明PPARs分为三种亚型,即PPARα、β、γ。PPARγ在动物脂肪代谢调控方面的生物学效应主要表现为,促进脂肪细胞早期分化和脂质正向代谢调节。它对脂质代谢几种基因表达的调控,最终会导致甘油三酯的清除增加,刺激细胞摄取脂肪酸、甘油三酯和极低密度脂蛋白的产生,提高高密度蛋白,因而它是体内脂质平衡的生理传感器,在维持体内脂质代谢动态平衡中起到枢纽作用。目前,对于该基因的研究主要集中在人、小鼠等动物的脂类代谢疾病问题上,对于牛、羊等家畜则主要集中在肉质改善问题上。本研究通过克隆徐淮山羊PPARγ基因,进行体外表达、亚细胞定位研究,在细胞水平上进行生物学功能验证,最后通过睾丸注射法介导PPARγ基因制备转基因绵羊。主要研究内容如下：1.PPARγ基因的克隆、序列分析及重组真核表达载体构建。设计合成PPARγ基因特异性引物,采用RT-PCR方法克隆出徐淮山羊脂肪组织中PPARγ,基因cDNA。将PPARγ基因扩增产物克隆至pMD19-T Vector中,酶切与测序结果表明pMD19-T-PPARγ构建正确。然后将PPARγ基因以融合表达方式克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体pEGFP-PPARγ,酶切与测序结果均表明pEGFP-PPARγ构建正确。序列分析结果表明,徐淮山羊PPARγ基因cDNA序列与鸡、小鼠、猪、牛及绵羊在该基因相应编码区的同源性分别为81%、89%、92%、98%、99%;PPARγ基因氨基酸序列与鸡、小鼠、猪、牛及绵羊的氨基酸同源性分别为92.9%、97.3%、98.3%、99.6%、99.8%,不同物种间的PPARγ有很高的保守性。2.体外重组PPARγ基因的表达及其亚细胞定位研究。用脂质体介导融合表达载体pEGFP-PPARγ转染NIH-3T3细胞系,48h后直接在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的位置,同时提取细胞总RNA与总蛋白。通过软件预测、RT-PCR以及Western Blotting方法鉴定该融合蛋白在细胞中的表达情况。软件预测结果表明PPARγ蛋白主要在细胞质中表达。荧光倒置显微镜下观察,重组PPARy荧光蛋白分布在细胞质内,细胞核内无荧光,同时在NIH-3T3细胞水平上实现了PPARγ基因的融合表达,融合蛋白大小约为80kDa,为建立稳定表达细胞系及制备转基因羊奠定基础。3. PPARγ基因表达诱导NIH-3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化。通过脂质体介导pEGFP-PPARγ转染NIH-3T3细胞系,经G418筛选15～20d获得阳性单克隆细胞系。然后添加成脂诱导剂(5ug/ml胰岛素、1uM地塞米松和0.5uM罗格列酮)诱导15d左右,采用油红O染色法鉴定,并通过RT-PCR法检测脂肪细胞特异性基因的表达。结果表明,诱导5d左右,少数细胞出现脂滴,位于细胞核周围,8～15d左右出现脂滴的细胞数增多,诱导率达30%；并且能够检测到脂肪特异性基因——脂蛋白酯酶基因(LPL) mRNA的表达,LPLmRNA大小约为1500bp。本研究在体外成功地建立了由PPARγ诱导NIH-3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化的模型,为进一步研究PPARγ诱导脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础。4.携带PPARγ转基因绵羊的制备及检测。采用脂质体转染法,将线性化的重组质粒pEGFP-PPARγ通过随机打点注射入性成熟的湖羊睾丸内。首次注射1周后重复注射1次,并于转染40d后使其与正常母羊自然交配产生F1后代。采用常规PCR、基因组DNA点杂交及Western blot技术检测外源PPARγ基因在湖羊体内稳定整合的能力。结果表明,PCR检测阳性率为20.6%,基因组点杂交阳性率达13.7%,Western blot检测阳性率达13.7%,初步证实外源基因PPARγ能整合到湖羊基因组中并能遗传给下一代。