研究背景和目的长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）被报道可以参与多种心血管疾病的病理生理过程。Lnc RNAs不仅存在于细胞内,也存在于循环中,并且在心血管疾病人群的外周血中呈现差异性表达。扩张型心肌病常常起病比较隐匿,缺乏针对性的治疗药物,心脏移植是晚期扩张型心肌病致心力衰竭的唯一有效治疗策略。此外,对于扩张型心肌病的早期诊断从而早期干预能够极大地改善患者的生活质量以及生存率。当前,外周血中的lncRNAs是否能够作为扩张型心肌病有效的预后标志物仍不清楚。因此,探寻扩张型心肌病致心衰患者外周血中差异性表达的lncRNAs可以为疾病的预防及诊断提供新的途径。方法和结果1.通过对10例对照以及10例扩张型心肌病患者的血浆进行了lncRNAs的芯片检测和表达谱分析,获得了3257个差异性表达的lncRNAs（P<0.05,倍数大于2）。2.在62例对照以及64例扩张型心肌病患者的血浆中对芯片筛选出的表达差异变化最显著的20个lncRNAs进行实时定量PCR检测验证,我们成功筛选出了在外周血中丰度较高的8个lncRNAs（ENST00000442293、ENST00000531663、ENST00000545794、ENST00000507296、uc002tkd.3、ENST00000532365、ENST00000567819、HMlinc RNA1548）,将这8个lncRNAs中与芯片分析结果对比,发现其中5个与芯片表达谱的变化一致,分别是ENST00000442293、ENST00000545794、ENST00000507296、ENST00000532365、HMlinc RNA1548。3.通过三种人源的心脏原代细胞进行lncRNA测序分析,我们筛选出2个lncRNAs（ENST00000507296、ENST00000532365）在心脏细胞中有表达;然后将这两个lncRNAs的表达水平与心功能指标进行相关性分析,结果表明,ENST00000507296表达量与左心室射血分数（LVEF）呈负相关（P<0.0001,r=-0.390）,与左心室舒张末期内径（LVEDD）（P<0.0001,r=0.354）及氨基末端脑钠肽前体（NT-pro BNP）（P<0.0001,r=0.307）呈正相关;ENST00000532365表达量与LVEF呈正相关（P<0.05,r=0.210）,与LVEDD（P<0.001,r=-0.309）及NT-pro BNP（P<0.01,r=-0.269）呈负相关。4.为了研究其表达水平与心衰的关系,进一步,我们对196例对照人群以及198例扩张型心肌病致心衰人群的外周血中这2个lncRNAs的表达水平进行了检测,扩张型心肌病组中ENST00000507296表达水平为对照组的5.4倍（P<0.001）,而ENST00000532365表达水平为对照组的0.62倍（P<0.001）;然后,通过受试者工作特性曲线（receiver operating characteristic,ROC）分析比较发现,ENST00000507296表达水平对于扩张型心肌病的诊断效率,即曲线下面积（AUC）为0.78;ENST00000532365表达水平对于扩张型心肌病诊断效率的AUC为0.61。5.为了研究这两个lncRNA的表达水平与扩张型心肌病患者预后的关系,我们检测了552例扩张型心肌病人的外周血中这两个lncRNAs水平,并对552例扩张型心肌病致心衰患者进行5年随访,经COX多因素回归分析,并校正年龄、性别、纽约心功能分级、NT-pro BNP、LVEF、LVEDD以及既往糖尿病病史后,外周血中lncRNA ENST00000507296表达水平越高的扩张型心肌病患者具有更高的事件发生率（相对风险比1.373,95%置信区间1.011-1.863）。结论综上所述,扩张型心肌病外周血中lncRNA ENST00000507296表达水平明显高于对照人群;此外,心衰患者外周血中ENST00000507296表达水平越高,则诊断为扩张型心肌病的可能性越大,并且其事件的发生率也越高。研究背景和目的我们和其他学者的大量研究表明,非编码RNAs在心血管系统的细胞和组织中不仅丰度很高,而且有重要生物学功能,其表达水平因为功能状态不同而发生改变,对心脏和血管疾病的病理生理过程有重要影响。心力衰竭心脏组织中有大量异常表达的micro RNAs（miRNAs）,其中miR-320在许多心力衰竭测序样本中均显示出统计学差异。但是,由于其整体差异倍数并不位于测序结果的前列并没有引起研究者们的兴趣。然而,我们前期研究表明,miR-320参与了多种心血管疾病的进展。那么,在心力衰竭中,miR-320在心脏不同类型细胞中变化是否一致呢?本项目旨在探讨心力衰竭过程中心脏不同细胞类型miR-320的表达及作用机制,为心力衰竭的治疗提供新的思路。方法和结果1.Mi R-320在心力衰竭患者心肌组织及血浆中表达明显升高。通过实时定量PCR检测,我们发现,在心力衰竭患者心肌组织中miR-320表达为对照组的2.37倍（P=0.034）,在心力衰竭患者的血浆中miR-320也表达升高（较对照组1.29倍,P<0.001）,此外其表达水平与左心室射血分数呈明显负相关（P<0.001,r=-0.5959）。2.Mi R-320主要位于心脏的心肌细胞以及成纤维细胞,在经主动脉弓缩窄术（TAC）诱导的心力衰竭模型中,心肌细胞miR-320表达升高,心脏成纤维细胞miR-320表达降低。通过RNA免疫荧光原位杂交技术,我们发现miR-320主要分布于心脏的心肌细胞以及成纤维细胞。并且TAC术后,心肌细胞miR-320表达增加,心脏成纤维细胞miR-320表达降低,而内皮细胞miR-320含量较少,并且对于TAC手术应激没有显著的变化。通过Langendorff灌流系统分离了TAC不同阶段小鼠的心肌细胞以及心脏成纤维细胞,进一步证实心肌细胞miR-320在TAC第3天就开始升高并且其高表达一直持续至TAC 70天,成纤维细胞miR-320在TAC第3天就开始降低并一直持续至TAC 70天。3.心肌细胞特异性高表达miR-320能够加重TAC导致的心功能损伤,成纤维细胞特异性高表达miR-320能够减轻TAC导致的心功能障碍。我们采用重组腺相关病毒9型分别携带心肌细胞特异性启动子c TNT和成纤维细胞特异性启动子FSP1干预TAC小鼠中miR-320在两种细胞中的表达水平,心脏超声以及心脏导管血流动力学均表明,心肌细胞特异性高表达miR-320能够加重TAC诱导的心功能损伤,成纤维细胞特异性高表达miR-320能够减轻TAC导致的心功能障碍。4.高表达miR-320的成纤维细胞可以分泌一系列蛋白从而减轻心肌细胞的肥厚,而心肌细胞miR-320的水平并不影响成纤维细胞的增殖。通过体外共培养实验表明,成纤维细胞过表达miR-320能够改善Ang II导致的心肌细胞的肥厚。这种改善效应并不通过miR-320的直接分泌引起,进一步蛋白质谱结果表明,成纤维细胞在过表达miR-320之后能够分泌一系列蛋白从而改善心肌细胞的肥厚。Ed U染色表明,心肌细胞过表达miR-320并不能够影响成纤维细胞的增殖。5.心肌细胞内转录因子ELF1的表达增高,导致Argonaute 2（Ago2）表达增高,使得miR-320降解减少;成纤维细胞内转录因子STAT1的表达降低,导致Ago2表达降低,使得miR-320降解增加。蛋白印迹实验以及实时定量PCR检测表明,在TAC术后,心肌细胞和成纤维细胞内Ago2和miR-320有着相同的变化趋势。单细胞测序、生物信息学预测及荧光素酶报告基因实验表明,心肌细胞丰富的转录因子ELF1在TAC术后表达增加,从而导致心肌细胞内Ago2的增加,成纤维细胞特异的转录因子STAT1在TAC术后表达降低,从而导致成纤维细胞内Ago2的降低。放线菌素D实验、荧光素酶报告基因结果表明,心肌细胞和成纤维细胞内Ago2通过影响miR-320的降解速率而调控miR-320的表达。6.心肌细胞内miR-320通过抑制普列克底物蛋白M家族成员3（PLEKHM3）的表达加重心肌肥厚,成纤维细胞内miR-320通过靶向干扰素诱导的跨膜蛋白1（IFITM1）抑制成纤维细胞的增殖。通过对心肌细胞及成纤维细胞进行Ago2的RNA免疫共沉淀测序,进一步RNA免疫共沉淀PCR、荧光素酶报告基因结合实验表明,心肌细胞和成纤维细胞内miR-320分别通过靶向PLEKHM3和IFITM1。在TAC诱导的心力衰竭中,心肌细胞内miR-320的高表达导致PLEKHM3的表达降低,从而加重心肌细胞的肥厚;成纤维细胞内miR-320的表达降低,进一步对于IFITM1的抑制作用减低,从而导致成纤维细胞的增殖增加。结论我们的结果证明,在心力衰竭的进展过程中,miR-320在心脏的心肌细胞表达增高,在心脏成纤维细胞中表达降低。心肌细胞内转录因子ELF1的表达增高导致Ago2的表达上调,从而使心肌细胞内miR-320的降解速率降低,更多的miR-320可以靶向抑制PLEKHM3的表达,从而加重心肌肥厚;成纤维细胞内转录因子STAT1的表达降低导致Ago2的表达减低,从而使得成纤维细胞内miR-320的降解增加,miR-320对于IFITM1的抑制效应减弱,从而成纤维的增殖增多。上述两种细胞中,miR-320的共同作用导致心力衰竭的进展。我们从miR-320出发探讨了心力衰竭过程中不同细胞类型中信号通路的变化,为心力衰竭的治疗提供了新的方向。