猪水疱病病毒（Swine vesicular disease virus,SVDV）属小RNA病毒科,肠道病毒属,该病毒可引起症状类似口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）的具有高度传染性的猪水疱病（Swine vesicular disease,SVD）。症状为蹄部与口部出现水疱并伴有破溃,无其它并发症情况下死亡率低,仅造成初生仔猪死亡。由于该病临床上难以与口蹄疫等水疱性疾病进行鉴别诊断,对经济造成极大的损失,且目前无可用的商品化疫苗,因此研究SVDV疫苗具有重要意义。病毒样颗粒（virus—like particle,VLP）具有类病毒衣壳结构,可引起特异性免疫反应的特点,且不具有感染性,它的出现为疫苗的研究提供了新的选择。巴斯德毕赤酵母表达系统具有操作简便,耗材廉价,及表达量高的特点,用于表达外源蛋白效果良好。本研究利用Pichia Pink Expression System表达SVDV结构蛋白前体P1与蛋白酶3CD基因制备VLP,为后续SVDV的VLP疫苗制备提供参考。1.根据酵母密码子偏好对SVDV结构蛋白前体P1基因及3CD蛋白酶基因序列进行优化合成,并分别将P1和3CD基因插入pPink-HC载体构建含有P1基因的pPink-SVDV-P1质粒与含有3CD基因的pPink-SVDV-3CD质粒。利用BglⅡ与Bam HⅠ为同尾酶的特性,将pPink-SVDV-3CD中3CD基因连同其表达盒一起由BglⅡ与BamHⅠ双酶切,插入由BglⅡ酶切的pPink-SVDV-P1中,构建重组表达质粒并命名为pPink-SVDV。2.将构建成功的pPink-SVDV通过电转化转入酵母感受态细胞中,利用腺嘌呤营养缺陷型培养基进行粉白斑筛选,挑斑选出高拷贝阳性转化子,经扩大培养后提取酵母DNA并利用P1及3CD基因特异性扩增引物进行PCR鉴定,筛选出正确重组的酵母。3.将鉴定正确的重组酵母经甲醇诱导表达,利用酸洗玻璃珠震荡破碎酵母细胞,使其释放蛋白,经SDS-PAGE鉴定,结果显示存在VP0、VP1和VP3结构蛋白,证明P1结构蛋白前体和3CD蛋白酶均成功表达且具有天然活性,3CD蛋白酶将P1结构蛋白前体分解为结构蛋白。在动态光散射法与透射电镜观察鉴定存在粒径约30 nm轮廓清晰的圆形空心颗粒,证明结构蛋白成功组装成为VLP。通过Western-bloting鉴定证明VLP可与抗原进行特异性结合,初步证明其具有一定免疫原性。综上,本研究利用pPink-HC作为载体,成功构建了含有SVDV的结构蛋白前体P1和蛋白酶3CD两个基因的酵母表达重组质粒pPink-SVDV,通过毕赤酵母表达系统成功表达出具有天然活性的外源蛋白,酶解产生的VP0、VP1和VP3结构蛋白被证明可以自行组装成为VLP,并具有一定免疫原性。本研究为SVDV的VLP疫苗的研究奠定了基础。