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以花生(Arachis hypogaea L.)汕油523种子为材料,在实验室前期研究的基础上,对花生种子中的2s抗菌蛋白双向电泳中的蛋白点2s-3c和2s-5a进行基因克隆,并成功构建原核表达载体pET32a-2s-3c,诱导表达后获得融合蛋白2s-3c；对此包涵体蛋白进行纯化和复性后,研究其部分性质。
从发育中期花生种子中提取总RNA,经反转录PCR合成cDNA第一链。根据双向电泳的MS-MS结果,设计简并引物,采用RACE方法,克隆得到2s-3c和2s-5a蛋白的基因。运用生物信息学手段对2s-3c和2s-5a编码蛋白的结构特点、性质与功能进行分析和预测,得知2s-3c的cDNA序列为438bp,编码145个氨基酸,分子量为16.92 KDa,等电点是5.73。2s-5a的cDNA序列为516bp,编码172个氨基酸,分子量为20.19KDa,等电点是5.7。2s-3c和2s-5a编码蛋白的N端都含有一个长约21个氨基酸的信号肽,都具有AAI结构域。
为了深入研究2s-3c蛋白的性质和功能,根据它的cDNA序列和原核表达载体的pET-32a的酶切位点设计了两条分别带有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,以反转录产物作为模板扩增全长cDNA。PCR产物和质粒经双酶切、纯化后利用T4连接酶进行连接并转入大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中。转化子经
抗性筛选、PCR及双酶切鉴定和测序分析,结果证明原核表达载体pET32a-2s-3c构建成功,IPTG诱导表达获得融合蛋白2s-3c,分子量为36.62 kDa。利用Ni柱纯化和稀释透析复性包涵体后,获得较纯的2s-3c融合蛋白。
对此融合蛋白进行体外抑菌研究发现,800μg/ml(40μg)的2s-3c融合蛋白对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和产气肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)均有显著的抑制作用,而400μg/ml(20μg)2s-3c融合蛋白对产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有抑制作用。
通过底物法测定2s-3c融合蛋白对胰蛋白酶的抑制作用,发现2s-3c融合蛋白具有胰蛋白酶抑制活性。
通过MTT法检测不同浓度2s-3c融合蛋白体外抑制A549细胞的生长,结果显示2s-3c融合蛋白对A549细胞的抑制作用呈现剂量依赖关系,在240μg/ml2s-3c融合蛋白作用24 h后,A549细胞生长抑制率可以达到87％以上,IC50约为126μg/ml。