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研究背景:脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一类高发病率、高致残率和高死亡率的脑疾病,给家庭、社会和国家带来沉重负担。目前针对ICH继发性损伤的治疗策略有限,治疗效果欠佳。因此,加强ICH病损机制的研究具有十分重要的临床意义。既往基于单一组学的ICH研究虽然丰富了我们对其损伤机制的认识,但单个组学难以准确捕捉、全面认识ICH复杂的病理生理变化。因此,我们从系统性和整体性角度出发,对ICH小鼠脑的转录特征和蛋白质特征进行整合分析,以加深对ICH病损机制的认识,为ICH的治疗寻找新的干预靶点和策略。目的:1.基于小鼠ICH模型,多维度探讨ICH后脑转录表达谱和蛋白质表达谱的变化及特征。2.整合转录组和蛋白组数据,系统性解析ICH后继发性脑损伤的病理机制,为ICH防治工作寻找新的分子靶点和治疗策略。方法:1.构建IV型胶原酶诱导的小鼠ICH模型,对血肿周围组织分别进行转录组学和蛋白组学分析,获得ICH小鼠脑转录组和蛋白质组表达谱。2.通过蛋白互作（Protein-protein interaction,PPI）分析、正则化典型相关分析（Regularized canonical correlation analysis,r CCA）和基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）整合转录组学和蛋白组学数据,构建ICH特征性基因-蛋白表达网络,挖掘ICH脑损伤相关通路和hub分子。3.通过RT-q PCR、WB验证通路中的关键分子以及m RNA-蛋白网络hub分子,通过ELISA检测ICH患者血浆中关键分子的含量。结果:1.H＆E染色显示ICH小鼠右侧纹状体可见巨噬细胞浸润和出血灶,行为学分析显示ICH小鼠改良加西亚评分明显降低,平衡木试验的行走距离明显缩短。说明ICH模型成功构建。2.ICH小鼠脑转录组学分析共鉴定出2218个差异基因（DEGs）,其中2065个表达上调,153个表达下调;脑蛋白组学分析共鉴定出353个差异表达蛋白（DEPs）,其中198个表达上调,155个表达下调。3.通过共表达互作网络筛选出10个候选hub分子,分别是Lyz2,C3,Serpina3n,Cfp,Ppbp,Hp,Serping1,Ctss,Itgb2和Anxa2;r CCA确定两个ICH特征性表达模块,分别涉及脂类代谢和免疫炎症过程;GSEA结果发现三个显著上调的基因集,分别是炎症小体复合物、白细胞介素-12负调控以及细胞焦亡。4.RT-q PCR和WB结果显示,m RNA-蛋白共表达网络hub分子Serpina3n,Itgb2和Ctss的表达显著上调,并且与ICH小鼠的行为学评分显著相关;ICH后焦亡通路相关分子NEK7,NLRP3,Caspase-1和GSDMD的表达显著上调。5.ELISA结果显示,ICH患者血浆中焦亡通路关键分子Caspase-1、下游促炎细胞因子IL-1β,IL-18和TNF-α水平较对照组明显升高。结论:本研究通过联合转录组和蛋白组的数据进行整合分析,发现Itgb2、Ctss和Serpina3n是与ICH神经功能相关的hub分子。脂类代谢紊乱和免疫炎症反应是急性期ICH的病理特征。ICH后继发性损伤与细胞焦亡介导的炎症反应有关,针对靶点Caspase-1以及焦亡通路NEK7/Caspase-1/GSDMD进行干预可能为ICH的治疗提供新策略。研究背景:当前针对中枢系统内局部损伤的研究众多,干预效果却参差不齐。着眼于外周免疫的调控途径为ICH的治疗提供了新的研究视角。肠道菌群可通过“肠-脑”轴对人体的肠道、外周及中枢系统中发挥强大的免疫调节作用。短链脂肪酸（short chain fatty acid,SCFAs）由肠道细菌发酵多糖类物质而产生,是饮食、肠道菌群和健康之间相互作用的主要参与者,近来被证实能够通过“菌-肠-脑”途径调节小胶质细胞分化从而发挥抗炎作用。鉴于小胶质细胞活化介导的炎症级联反应是导致ICH后神经损伤的重要始动环节,我们猜想SCFAs可能在ICH后发挥神经保护作用。但目前对SCFAs与ICH之间关系的认识十分有限,亟需进一步探索性研究。目的:1.揭示ICH、肠道菌群和SCFAs三者之间的相关性和量效关系。2.评估丁酸钠（sodium butyrate,Na B）对ICH小鼠的肠道、外周和中枢的影响。3.探讨Na B在ICH小鼠中发挥神经保护作用的潜在分子机制。方法:1.在成功构建ICH模型的基础上,通过16S r RNA测序技术绘制ICH小鼠的肠道微生物特征图谱,找出ICH后改变的差异菌群.2.利用气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS）和高效液相色谱串联质谱（Liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS）靶向测序技术,分别检测ICH小鼠粪便和血清中总SCFAs及各类SCFA含量。3.对ICH小鼠灌胃三种不同浓度的Na B（100m/kg,300mg/kg和600 mg/kg）,通过改良加西亚试验和平衡木行走试验评估小鼠在术后24小时和72小时的神经功能。通过干湿重法检测小鼠脑含水量。通过伊文思蓝渗漏实验和Western blot实验评估血脑屏障通透性。4.通过TUNEL染色、FJC染色和Western blot实验分别评估血肿周围区域神经元凋亡、变性的数量以及凋亡相关蛋白的表达水平。通过免疫荧光和ELISA试验评估小鼠肠粘膜屏障功能。5.通过Western blot实验和双重免疫荧光染色分别研究焦亡通路中关键蛋白NEK7、GSDMD-N和Caspase-1 p20的表达规律以及NEK7的细胞定位。采用CO-IP实验检测NEK7与NLRP3的相互作用,Western blot实验检测焦亡通路NEK7/Caspase-1/GSDMD中相关蛋白的表达情况。通过免疫荧光染色检测小胶质细胞焦亡情况。结果:1.16S r RNA结果显示ICH后肠道菌群在组成结构、菌群丰度方面发生改变,差异菌群特征图谱显示产SCFAs的细菌群类变化显著。PICRUSt功能分析显示差异菌群主要在“代谢”功能中富集,其中4条显著差异代谢通路分别是“丁酸代谢”、“泛醌和其他萜类醌生物合成”、“次级胆汁酸生物合成”和“四环素生物合成”。2.ICH后粪便SCFAs总含量下降,其中乙酸、丙酸和丁酸的含量明显降低,异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和异己酸的含量没有明显变化。ICH后血清SCFAs总含量下降,其中丁酸的含量明显降低。3.与Sham组相比,ICH+Vehicle组在术后24小时和72小时的神经功能缺损和脑水肿明显加重,而ICH+Na B（600 mg/kg）组的神经功能损伤和脑水肿程度明显减轻。与Sham组相比,ICH+Vehicle组的伊文思蓝渗漏量明显升高,而灌胃Na B（600 mg/kg）后其渗漏量减少。同时,与Sham组相比,ICH+Vehicle组中蛋白Occludin的表达下降,MMP-9的表达升高,而灌胃Na B（600 mg/kg）可逆转以上趋势。4.与Sham组相比,ICH+Vehicle组中TUNEL和FJC阳性神经元数量增加,蛋白Bcl-2与bax的比值降低,而给予Na B（600 mg/kg）治疗后TUNEL和FJC染色中共标的阳性神经元数量明显减少,蛋白Bcl-2与bax的比值回升。此外,与Sham组相比,ICH+Vehicle组中肠粘膜屏障的紧密连接蛋白Claudin-1和黏蛋白Muc2的平均荧光强度下降,血清LBP、D-LA和DAO的含量升高,而给予Na B（600mg/kg）治疗后可逆转以上趋势。5.蛋白NEK7的表达水平于ICH后24h达到高峰,72h开始逐渐回落,7d恢复至与sham组相近水平。蛋白GSDMD-N和Caspase-1 p20与NEK7的表达规律一致。免疫荧光染色显示,内源性NKE7主要在小胶质细胞和神经元中表达,并且在ICH后的表达明显增加。6.CO-IP结果显示,ICH后NEK7与NLRP3互作,形成NEK7-NLRP3复合物。Western blot结果显示,与Sham组相比,ICH+Vehicle组中蛋白NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N,IL-1β的表达在ICH后24小时升高,而给予Na B（600 mg/kg）有效抑制了ICH后焦亡通路NEK7/Caspase-1/GSDMD的激活。同时,给予Na B（600 mg/kg）能够降低ICH后血肿周围组织中Caspase-1阳性小胶质细胞的数量。结论:本研究结果表明,ICH导致肠道菌群失调,粪便及血清SCFAs代谢谱紊乱,其中丁酸代谢途径的改变尤为显著。给予Na B能改善轻ICH小鼠的神经功能障碍和脑水肿,并通过抑制小胶质细胞介导的炎性焦亡反应,促进神经元的抗凋亡作用以及肠粘膜屏障的功能修复,从而增强ICH后血肿周围组织与外周的总抗炎防御能力。