【摘 要】
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目的:1、通过酶消化法获得正常组和糖尿病足（Diabetic foot,DF）组脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）;2、通过观察ADSCs形态、表面标志物表达、增殖能力、成脂与成骨分化、衰老染色以及鉴定基因表达差异等方式了解DF患者ADSCs的生物学特性;3、探索DF患者脂肪干细胞条件培养基（Adipose-derived stem cells-c
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目的:1、通过酶消化法获得正常组和糖尿病足（Diabetic foot,DF）组脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）;2、通过观察ADSCs形态、表面标志物表达、增殖能力、成脂与成骨分化、衰老染色以及鉴定基因表达差异等方式了解DF患者ADSCs的生物学特性;3、探索DF患者脂肪干细胞条件培养基（Adipose-derived stem cells-conditioned medium,ADSCs-CM）对成纤维细胞增殖和迁移的影响。方法:1、2021年1月至2021年12月,在联勤保障部队第九四〇医院烧伤整形外科和兰州大学第二医院烧伤整形与创面修复外科,收集4例50-70岁DF患者和同期同龄9例健康整形患者脂肪,为全厚皮片修剪后废弃的新鲜脂肪组织;2、经酶消化法获取正常组和DF组ADSCs并培养、传代,用第2或3代细胞进行实验;3、在显微镜下观察正常组和DF组ADSCs的形态学差异,采用流式细胞术来检测两组ADSCs表面标志物表达水平,利用CCK-8法检测两组ADSCs在体外培养的细胞增殖能力差异,诱导成骨、成脂分化后染色观察比较两组ADSCs多向分化潜能,衰老染色观察两组ADSCs衰老特征,q PCR检测各组PPARγ、HGF、typeⅢcollagen以及Hox基因（Hoxa5,Hoxa9和Hoxa10）的表达水平;4、复苏成纤维细胞并培养至第2代,制备ADSCs条件培养基（ADSCs-CM）,通过CCK-8法检测各组条件培养基对成纤维细胞的增殖能力的影响,用各组条件培养基培养划痕后的成纤维细胞,在不同时间点观察划痕创面愈合的面积并拍照,观察各组条件培养基对成纤维细胞的迁移能力的影响;5、使用SPSS 22.0软件进行各组数据统计分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1、正常人和DF患者ADSCs均匀接种于细胞培养皿后细胞逐渐开始贴壁变形,换液2-3次后在相差显微镜下观察,两组原代ADSCs贴壁后形态多为梭形,部分细胞可见伪足,两组原代ADSCs形态无明显差异。传代至第3代时,DF组ADSCs胞体更为狭长,伸出的伪足数目较正常组更为明显;2、两组ADSCs的阳性表面标志物CD90、CD105表达率均在98%以上,阴性表面标志物CD34、CD35、CD45表达率均在2%以下,两组ADSCs表面标志物的表达水平并无明显差异,均符合ADSCs的表面标志物表达水平标准;3、DF组ADSCs增殖能力低于正常组ADSCs;4、正常组和DF组ADSCs均有成脂分化、成骨分化的能力,染色后比较,正常组ADSCs成脂分化和成骨分化能力明显高于DF组ADSCs;5、取第3代ADSCs行β-半乳糖苷酶染色,DF组ADSCs的阳性细胞数明显高于正常组ADSCs,且差异有统计学意义（P＜0.05）;6、DF组ADSCs PPARγ、HGF、typeⅢcollagen、Hoxa5、Hoxa9和Hoxa10基因的表达水平较正常组低;7、在一定时间（36h）内,两组ADSCs-CM均可以促进成纤维细胞的增殖与迁移,但正常组的促进作用明显优于DF组。结论:DF患者内环境损害自身ADSCs的增殖能力、多向分化潜能并表现出比正常组ADSCs明显的衰老特征;两组ADSCs-CM都能促进成纤维细胞的增殖和迁移,但DF组ADSCs对成纤维细胞增殖和迁移的促进作用弱于正常组。
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