研究目的:药物性肝损伤（Drug induced liver injury,DILI）,是药源性疾病中最重要的一种,现已成为限制医药事业发展和威胁人类健康的主要问题。传统中药（TCM）作为一种纯天然来源的药物,在临床上的使用愈加广泛,其不良反应的发生也愈加频繁,尤其是对肝脏的损伤。长期以来,这种药物不良反应在很大程度上限制了TCM的发展。与病毒、自身免疫和遗传性肝病相比,DILI在诊断及治疗方法上尚未有重大研究进展。因此,与DILI相关的机制研究有助于为临床诊断和治疗提供一种新的思路,同时,期望为解决传统中药的用药安全问题提供一些理论支持。目前研究药物性肝损伤最常见的方法是采用对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）诱导小鼠发生肝损伤,其预后主要取决于肝细胞死亡与再生之间的平衡。已有研究报道,发现Sirtuin6（SIRT6）在炎症相关的细胞死亡中发挥着重要的作用,但关于SIRT6在DILI中所发挥的作用尚未有相关研究。因此,这一部分亟待我们进一步探究。研究方法:1.利用实验室前期成功构建的SIRT6-Flox小鼠与Alb-Cre工具鼠交配,得到SIRT6-LKO小鼠及同窝的对照小鼠,通过Southern blot和Western blot鉴定小鼠基因。2.腹腔注射APAP诱导DILI模型,下腔静脉采血,取出肝脏。通过比较血清转氨酶及肝脏染色的损伤程度,确定造模是否成功以及肝脏SIRT6缺失对小鼠DILI的影响。3.通过TUNEL染色检测SIRT6与肝细胞凋亡是否相关。4.在小鼠肝原代细胞及肝组织中通过细胞免疫荧光染色、Western blot、免疫组化染色、q PCR方法检测对照组及APAP组中SIRT6对肝细胞坏死相关分子受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）的调控作用。利用SIRT6过表达的Hep G2细胞系和SIRT6敲减及转小干扰的Huh-7细胞系,验证SIRT6对RIPK1的调控作用。通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）实验,验证SIRT6和RIPK1间是否存在相互作用。5.通过Western blot实验验证SIRT6-LKO加重药物性肝损伤是否依赖于程序性坏死途径。6.通过Western blot和q PCR实验验证SIRT6是否通过RIPK1介导细胞焦亡导致肝损伤。结果:1.基于课题组前期成功构建的SIRT6-LKO与WT小鼠,选择8-10周龄的雄鼠通过腹腔注射APAP成功诱导DILI模型,对比APAP组SIRT6-LKO与WT小鼠的血清转氨酶及肝脏组织HE染色结果,表明肝脏SIRT6敲除加重APAP诱导的肝损伤。2.TUNEL染色结果中,经比较对照组与APAP组染色结果,发现APAP可诱导小鼠肝细胞凋亡,再结合APAP组中WT与SIRT6-LKO小鼠染色结果,表明肝脏SIRT6敲除加重APAP诱导的肝细胞凋亡。3.分别比较不同处理方法的两种基因型小鼠肝脏中RIPK1的表达情况,发现SIRT6-LKO小鼠的肝脏中RIPK1表达均较WT小鼠高,再结合Hep G2细胞中SIRT6过表达后RIPK1较对照组表达量显著降低这一结果,表明肝脏SIRT6的缺失促进了RIPK1的表达。4.在RIPK1介导的程序性坏死通路中,下游的混合系激酶区域样蛋白（Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL）激酶会被RIPK3磷酸化,而P-MLKL最终导致细胞程序性坏死。由于在小鼠肝脏中未检测到被磷酸化激活的MLKL,且Caspase-8的存在表明程序性坏死途径被阻止,即SIRT6敲除导致肝损伤加重不依赖于RIPK1介导的程序性坏死途径。5.APAP可通过激活JNK通路,导致细胞死亡。本研究发现APAP组SIRT6-LKO较WT小鼠的JNK磷酸化程度高,表明SIRT6缺失诱导所致小鼠肝损伤加重部分是通过RIPK1-JNK凋亡通路介导。6.RIPK1和Caspase-8可通过剪切GSDMD驱动细胞焦亡,本研究发现SIRT6缺失诱导RIPK1表达升高进而导致GSDMD-N’、NLRP3、IL-1β、IL-18也呈升高趋势。与RIPK1不同的是在PBS组中WT与SIRT6-LKO小鼠的GSDMD-N’蛋白表达呈现出从无到有的变化,而GSDMD又是焦亡的效应蛋白,表明SIRT6可通过抑制焦亡发生减轻APAP诱导小鼠的肝损伤。结论:本研究首次发现并证实了SIRT6和RIPK1间存在相互作用,且SIRT6可通过负向调控RIPK1蛋白表达,抑制肝细胞死亡,减轻肝损伤。此外,基于RIPK1和Caspase-8可通过剪切GSDMD使细胞发生焦亡的理论基础,我们提出新的科学假设并通过实验证实了这一假设,即在DILI模型中小鼠肝脏SIRT6的敲除诱导RIPK1和Caspase-8的剪切体表达增加,继而剪切GSDMD形成GSDMD-N’,同时促进IL-1β、IL-18等前炎症细胞因子的成熟和分泌,导致细胞焦亡,最终通过焦亡通路介导肝细胞死亡。有意思的是在检测GSDMD分子的剪切体蛋白表达量时,意外地发现在小鼠肝脏中GSDMD-N’的表达与SIRT6的有无呈显著相关性,因此进一步猜想SIRT6在DILI中的机制并非必须通过RIPK1介导焦亡通路,而是通过直接影响GSDMD的剪切活性调控焦亡通路。关于SIRT6究竟如何通过调控GSDMD,减少肝细胞死亡,保护肝脏免受DILI便是下一步研究的主要任务。总之,本研究发现了SIRT6可通过抑制细胞焦亡减轻APAP诱导的DILI,且这一发现使SIRT6有望成为临床预测和治疗DILI的有效靶点。