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本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 细胞核亚结构paraspeckle的功能及调控机制研究 Paraspeckle小体是一类广泛存在于哺乳动物细胞核中的由长非编码RNANEAT1和p54nrb,PSF,PSPC1等蛋白质组成的细胞核亚结构。NEAT1作为paraspeckle的骨架分子,决定该细胞核亚结构小体的形成。之前的研究发现,paraspeckle的重要功能之一是通过核心蛋白p54nrb参与调控3UTR区域含有反向重复序列(如人类细胞中的反向重复Alu序列,IRAlus)的mRNA的核滞留。当细胞受到刺激时,这些核滞留的mRNA会被运出细胞核进行翻译。但是目前对于这一过程是如何被精细调控的仍然未知。 本学位论文研究阐明蛋白精氨酸甲基转移酶CARM1,通过甲基化细胞核亚结构paraspeckle小体的核心蛋白组分p54nrb,并同时抑制paraspeckle骨架长非编码RNANEAT1的转录,协同调控滞留在paraspeckle中的含IRAlus mRNA在不同生理条件下的出核活动。 本学位论文通过体外甲基化实验及体内结合实验首次发现蛋白精氨酸甲基转移酶CARM1定位于paraspeckle中并甲基化paraspeckle核心蛋白组分p54nrb碳端的多个精氨酸残基。敲低CARM1会增加p54nrb与含IRAlus的mRNA结合并促进这类mRNA在paraspeckle中的核滞留。进一步的体外pull down结合实验显示,p54nrb碳端的coiled coil结构域是结合双链RNA(IRAlus为双链RNA结构)所必需的。而CARM1通过甲基化p54nrb coiled coil结构域附近的3个甲基化位点抑制p54nrb与双链RNA的结合。同时,CARM1作为转录辅因子结合在paraspeckle结构RNA组分NEAT1的启动子区域并抑制其转录,进而减少paraspeckle的形成。因此,CARM1通过甲基化p54nrb和抑制NEAT1转录这两个层面来调控paraspeckle所介导的含IRAlus的mRNA在细胞核中的滞留。当细胞受到外界刺激时(如poly(I∶C)),CARM1在paraspeckle以及NEAT1启动子上的定位减少,一方面降低p54nrb甲基化水平,从而增强p54nrb与含IRAlus mRNA的结合;另一方面促进NEAT1表达,使细胞核亚结构paraspeckle小体增多。两方面协同作用,进而抑制含IRAlus mRNA的出核和翻译。 该研究阐明了细胞核亚结构paraspeckle小体调控mRNA出核之谜,丰富了人们对paraspeckle功能、蛋白质翻译后修饰调控蛋白质-RNA复合物、长非编码RNA的转录以及基因表达调控的认识。 第二部分 核富集RNA表达载体snoVectors的功能检测 越来越多的研究表明长非编码RNA (Long noncoding RNA,lncRNA)在基因表达调控和许多生物学过程中发挥重要的功能。不同于mRNA转运到胞浆中指导翻译,许多lncRNA在细胞核内发挥功能。因此,研究这类在细胞核内发挥功能的lncRNA需要一类能将RNA稳定表达在细胞核里的过表达载体。我们实验室根据前期研究发现的来源于内含子的两端以snoRNA结尾的lncRNAsno-lncRNAs稳定地存在于细胞核中的特性设计并构建了核富集RNA表达载体“snoVectors”,并验证了该载体可以产生类似sno-lncRNAs结构的核富集RNA。本课题以lncRNA mNEAT1为例,证明snoVectors载体可以将mNEAT1外源过表达在细胞核中,并与p54nrb蛋白共定位于paraspeckles中,参与paraspeckle介导的IRAlus mRNA的核滞留。因此,snoVectors载体可以作为研究细胞核RNA 功能的研究工具。