RNAi是一种基因沉默技术,可引起细胞内同源的mRNA发生降解,普遍存在于真核生物中。通过基因工程技术构建昆虫关键基因的dsRNA片段导入受体植物可显著提高植物的抗虫性。棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种全球广泛存在的农业害虫。本论文以4个棉铃虫CDA基因为研究对象,分别构建到hpRNA植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其转化烟草,获得具有卡那霉素抗性的植株。随之对抗性植株进行PCR和RT-PCR鉴定以及T1代转基因烟草植株发芽率进行卡方检验。最后挑选单拷贝的T0代植株叶片进行抗虫性实验研究。具体研究内容以及结果如下:1、构建含有目的基因CDA的hpRNA植物表达载体以本实验室已有的pUCm-HaCDA质粒作模板进行PCR扩增获得片段大小均在500~650bp之间的4个棉铃虫CDA基因片段。利用TA克隆法将其分别连接到中间载体pUCBXK质粒上。之后用Golden-gate克隆法将正向连接的目的基因片段构建到hpRNA植物表达载体上,经过PCR和测序技术鉴定获得4个双元表达载体。将其质粒电击转化至农杆菌感受态细胞LBA4404中,获得含有4个棉铃虫CDA基因的农杆菌菌株。2、转基因烟草植株的获得和鉴定利用农杆菌介导法将4个棉铃虫CDA基因转化烟草,经过组织培养技术初步获得的具有卡那霉素抗性的植株数为转HaCDA5a 11株,转HaCDA5b 11株,转HaCDA1 10株和转HaCDA2 16株。经过PCR和RT-PCR鉴定分别获得转基因烟草植株数为转HaCDA5a 9株,转HaCDA5b 8株,转HaCDA1 8株和转HaCDA2 11株。随后选取转每个CDA基因的阳性植株中的5株的T0代种子种植于含有卡那霉素的MS固体培养基中,对其T1代植株发育率进行卡方检验,符合孟德尔分离比的单拷贝植株数分别为转HaCDA5a 5株,转HaCDA5b 5株,转HaCDA1 5株和转HaCDA2 4株。3、转HaCDA基因的烟草植株的抗虫性分析用单拷贝的T0代转HaCDA烟草叶片和野生型烟草叶片(对照组)饲喂棉铃虫幼虫,结果显示饲喂24h后幼虫对转HaCDA5b烟草叶片的咬噬程度轻于其他3个转棉铃虫基因的,且它们均轻于对照组叶片的。连续饲喂6天后以转HaCDA5b的烟草叶片为食的幼虫死亡率最高,对照组死亡率最低,两者具有显著差异性。收集饲喂时间为24h、48h和60h的幼虫,用qRT-PCR检测目的基因沉默效率,结果显示60h时以转4个棉铃虫CDA烟草叶片为食的幼虫对应目的基因的相对表达量均表现出一定程度的下降,其中转棉铃虫CDA5b叶片的特异性沉默效率最高。转基因烟草叶片对幼虫目的基因的沉默效率与对照组相比,均表现出显著差异性。本研究为筛选新型的杀虫剂靶标基因提供一定的实验依据,同时也为利用RNAi技术防治棉铃虫以及其他农业害虫提供一些新的建议。