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目的 通过对培养后的角膜缘上皮细胞进行深低温保存，检测复苏后细胞的结构和功能，来探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。 方法 实验室阶段：(1)角膜缘上皮细胞的培养：将切取的兔角膜缘组织剪成1mm×1mm小组织块，经消化酶处理后培养在12孔板中，培养细胞至形成单层；(2)角膜缘上皮细胞的深低温保存和复苏：形成单层的细胞消化后制成悬液，分别用两组冷冻保护液：A组为32.5％F12+32.5％DMEM+20％小牛血清+15％甘油；B组为90％小牛血清+10％二甲基亚砜(DMSO)按阶段降温保存在液氮里，冻存半月、1月和2月分批取出，进行复温和复温后处理；(3)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞的传代培养和鉴定：将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞制成的悬液传代至无上皮细胞的羊膜上再培养，采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质；(4)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞活性比较：通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法、台盼兰染色来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。 动物实验阶段：将40只角膜缘干细胞损伤的模型兔随机分成单纯羊膜组、未冷冻细胞组、DMSO保存细胞组和甘油保存细胞组，每组10只，用传代培养2周后的角膜缘上皮细胞作移植实验，观察细胞体外功能完成情况来进一步比较深低温保存前后角膜缘上皮细胞的活性。 结果 (1)传代细胞免疫组化结果显示：鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、AE1单克隆抗体染色呈阳性反应，AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应；(2)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞活性比较：传代细胞冻存后的比未冻存的贴壁、生长均滞后1～2天，未冻存细胞约10天左右形成单层，而DMSO保护液组需要12～14天，甘油保护液组难形成良好单层；深低温保存后的细胞电镜检查均有不安徽医科大学硕士学位论文同程度细胞水肿，甘油组损伤较重，再培养7天后形态结构均恢复正常;MTT法和台盼蓝染色比较冻存前后细胞的增殖活性和存活率，结果显示复苏当天冻存后的比未冻存的细胞检测值低，差异显著(尸<0.05，但培养5天后无显著差异(P>0.05)，甘油组和DMSO组间有显著性差异(尸<0.05)，各冻存组不同冻存时间测得值无显著差异(尸>.05);(3)传代培养细胞同种异体移植表明:移植细胞组动物术眼4周后的AES染色阳性，PAS染色阴性或弱阳性，移植羊膜组AES染色阴性，PAS染色弱阳性;冷冻后细胞移植术后角膜评分高于未冷冻细胞，其中未冷冻细胞与DMSO保存细胞组比较，差异无显著性(尸>0.05)，和甘油保存细胞组相比差异有显著性(尸<0.05)。结论角膜缘上皮细胞深低温保存后仍保持上皮细胞特性，传代培养后细胞中含有较多有高增殖力的干细胞;DMSO保护液比甘油保护液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行，选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养，其细胞活性和结构与原代相似。