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水貂是高档毛皮用经济动物,目前以人工饲养为主。伴随皮张生产而产生的大量水貂胴体引起广泛关注,由于目前国内外尚缺乏对水貂胴体成分的科学认识和加工技术,造成水貂胴体处理十分混乱,很多养殖户利用水貂胴体加工成生鲜料用于水貂和其它毛皮动物的饲料,这给毛皮动物养殖业带来非常大的生物安全隐患。为明确水貂胴体中病毒携带情况以及其对小鼠安全性,本研究对危害水貂较为严重的阿留申病病毒(ADV)、肠炎细小病毒(MEV)与犬瘟热病毒(CDV)建立了三重PCR快速检测方法,用该方法对来自山东主产区的水貂胴体开展检测,对分离的阿留申病毒株和犬瘟热病毒株进行变异分析,用人工感染试验分析了阿留申病毒株对小鼠的安全性。结果如下:分别设计合成了MEV、CDV和ADV三种病毒基因特异性引物,优化反应条件,建立了快速检测三种病毒的三重PCR方法,该方法可同时扩增出MEV 694bp、CDV402bp和ADV 1025bp的特异性基因目的条带,灵敏性试验结果最低核酸检出量为MEV3.13×10~5 copies/μL、CDV 1.94×10~5copies/μL和ADV 2.56×10~5copies/μL。试验结果证明成功构建了三种病毒的三重PCR检测方法,临床样品检测结果证明三重和单一PCR检测结果相符。在临床上可快速的检测单一或混合感染病例。利用构建的三重PCR检测方法,对山东省共6个水貂的主要养殖地区的379份送检和采集的样品进行检测,结果显示ADV单一感染率为2.9%-8.6%;MEV的单一感染率为4.9%-8.5%;CDV单一感染率为5.1%-6.3%;ADV和MEV混合感染率为1.4%-3.5%;ADV和CDV混合感染率为1.4%-3.4%;MEV和CDV混合感染率为0.9%-4%;三种病毒混合感染率为0.9%-2.1%。将检测出ADV阳性的病料进行毒株的分离鉴定,并作基因同源性分析。结果显示,成功分离出一株ADV毒株,命名为ADV-SD,该毒株在猫肾传代细胞(CRFK)上盲传至第5代第6天出现明显的细胞病变(CPE)。扩增ADV的VP2蛋白全基因序列与国内外发表的毒株VP2基因同源性比较分析,结果显示ADV-SD分离株VP2蛋白基因与其它发表毒株的同源性在94.1%~96.1%之间;对ADV-SD-VP2基因绘制进化树,发现分离株与国内分离株不处在同一进化支,而是处在国内株(登录号:GU183265-LN2)和俄罗斯株(登录号:KJ174161)之间的进化中间态。将检测出CDV阳性的病料内的毒株进行分离鉴定,并作基因同源性分析。结果显示,成功分离一株CDV,命名为CDV-SD;该毒株在Vero细胞上在盲传至第6代时未出现明显的CPE(细胞融合呈露珠状),但可见大量的细胞死亡;对分离株的H蛋白基因同源性分析结果显示该毒株与发表的山东参考毒株的一致性高达99%。对CDV-SD-H基因绘制进化树,发现分离株与国内三株山东地区分离株处在同一进化支,(山东地区分离株登录号为KF880682、KF880683、KF880684)。ADV分离株感染小鼠结果显示,试验组的8只小鼠均感染ADV,但感染小鼠体重以及内脏器官发育指数无显著性差异,剖检无明显病变,血液常规检测结果显示感染小鼠的淋巴细胞总数及其比率显著增加(P<0.05),血小板总数、粒细胞总数及其比率以及中间细胞比率显著下降(P<0.05),其它指标差异不显著(P>0.05);感染小鼠H9流感株的抗体效价较对照组小鼠显著下降(2~3 vs 2~4,p<0.05);对小鼠体内的ADV分离鉴定,并比较VP2基因同源性,结果显示小鼠体内携带的ADV毒株与原毒株的同源性为99.2%,表明ADV能够感染小鼠并出现微弱的变异。通过以上研究,建立的快速检测ADV、MEV、CDV的三重PCR方法为了解水貂及其胴体携带三种病毒情况、临床流行病调查、鉴别诊断提供重要方法依据;明确山东省水貂主产区内水貂胴体中3种病毒的感染情况和ADV、CDV分离株与其它参考毒株间的变异进化关系;评估了ADV分离株对小鼠的安全性。这些为认识水貂胴体生物安全、探讨水貂胴体分类分级利用标准提供科学依据。