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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属于无患子科龙眼属常绿木本果树,具有较高的营养价值与药用价值。龙眼胚胎发育是影响果实品质与产量的重要因素;然而龙眼胚胎发育的研究存在诸多不利因素影响,而龙眼体胚发生系统作为木本植物优良模式体系,是龙眼胚胎发育研究的良好替代材料。miR159/319家族是植物中特有且保守的一类miRNA,在植物生长发育、营养相变及逆境响应等方面发挥着重要的作用,然而miR159/319家族在龙眼体胚中的调控机制尚不清楚。本研究借助于龙眼体胚发生系统,对该过程中参与调控的miR159/319进行序列分析、初级体克隆、启动子分离、靶基因和eTMs预测及功能验证,以期为深入miR159/319在龙眼胚胎发育过程中的调控机制与功能研究提供新的线索。主要研究结果如下:1龙眼miR159/319家族成员筛选、克隆及生物信息学分析利用龙眼miRNA文库与龙眼转录组数据库,获得miR159/319家族成熟体与前体成员各10个。生物信息学分析发现龙眼miR159/319家族成员的同源性与植物属性及生成部位相关;pre-miR159/319生成成熟体的方式具有多样性,其中pre-miR159a可生成 miR1 59a-3p 和 miR1 59a-5p,pre-miR319a 可生成 miR319a-3p.1、miR319a-5p.1 和 miR319a-5p.2。利用GeneRACE和SMARTer（?）RACE试剂盒逆转录的方法,对miR159a/319a进行初级体克隆,分别获得全长序列为542nt和797nt,鉴定了其转录起始位点;序列比对发现pre-miR159a/319a主要生成于初级体的保守区域,并且龙眼miR159a/319a基因均不含内含子。2龙眼miR159a/319a启动子克隆与分析利用龙眼基因组提取pre-miR159a/319a上游3000nt序列,采用PCR克隆获得2771nt和2540nt启动子。CpG岛预测结果显示miR159a/319a启动子均不存在CpG岛。顺式作用元件分析发现,龙眼miR159a/319a启动子除了含有大量TATA-box和CAAT-box外,还包含了光响应元件、应激响应元件、激素响应元件、胚乳表达响应元件、生长发育响应元件及部分功能未知元件,但仅miR159a启动子含有影响龙眼体胚发生起“主导作用”的“TGA-element”生长素响应元件。3龙眼miR159/319家族的靶基因及eTMs预测与验证psRNAtarget预测结果显示miR159/319家族分别包含了 19和13个靶基因,存在相同miRNA调控多个靶基因及多个miRNA调控相同靶基因现象,预测的结合位点均位于基因的ORF区域;利用改良的 RLM-RACE 法验证了 MYB33-like、GAMYB-like、SPL6-like、SPL9-like和SPL1 6-like分别与其miRNA间存在裂解关系。TAPIR预测结果显示miR159/319家族分别包含了 31和25个潜在的eTMs,其中仅eTM31251与eTM14439为lncRNA基因,其余均为编码蛋白基因。利用miRNA成熟体人工合成模拟物对miR159a-3p与miR319a-3p.1进行过表达处理,结果表明miR159a-3p与eTM1866、eTM31251间存在潜在的负调控关系。4龙眼体胚发生早期、不同胚性培养物及相关激素处理下miR159a/319a的表达模式分析龙眼体胚发生早期研究表明,0～3d内质量与形态均无明显变化,第6d开始快速增殖且在细胞团中出现大量凸起的早期球形结构,第12d可形成典型球形胚;qPCR结果显示,miR159a/319a在0～12d内呈显著上调表达,而其靶基因与eTMs均呈下调表达,推测miR1 59a/319a调控机制参与了龙眼早期体胚发生。龙眼不同胚性培养物的结果表明,miR159a/319a随着龙眼体胚紧实程度的增加而上调表达,再次验证了 miR159a/319a可促进龙眼早期体胚发生。采用龙眼EC进行不同激素诱导处理,研究结果表明miR159a在高浓度2,4-D中抑制表达,低浓度则促进表达,在ABA和GA3诱导下表达无明显变化,在乙烯诱导中呈“W”型表达趋势;而龙眼miR319a则在2,4-D及ABA处理中均随着浓度上升而下调,在GA3诱导中无明显变化,在乙烯诱导中呈“N”型表达趋势。5龙眼miR159a在龙眼体胚发生早期的功能验证利用miRNA成熟体人工合成模拟物miR159a-3p-agomir和高效阻断剂miR159a-3p-antagomir,对龙眼体胚进行转化试验。结果发现miR159a-3p过表达倍数过高可抑制球形胚的形成,并使细胞裂解致死,miR159a-3p过表达倍数适中可促进球形胚的形成,而miR159a-3p抑制表达则推迟龙眼球形胚的形成。定量结果发现,促进球形胚发生的处理组中 miR159a-3p、SPL6-like、SPL16-like和 SPL9-like表达水平均显著高于CK组,MYB33-like、GAMYB-like和miR1 56a表达水平显著低于CK组;推迟球形胚发生的处理组中则与之相反,进一步验证了 miR159a-3p调控网络在龙眼体胚发生早期具有重要的作用。通过miR159a-3p和miR156a过表达与抑制表达组合处理,发现miR159a-3p过表达处理可抑制miR156a的表达,而miR159a-3p抑制表达处理则促进miR156的表达,该处理中miR159a-3p的靶基因MYB33-like、GAMYB-like与miR156表达趋势几乎一致,验证了龙眼miR159a-3p对miR156a存在的潜在调控关系。