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烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是一种腐生性霉菌,分布于潮湿的土壤、动物垫料以及霉变饲料中。许多研究指出,烟曲霉菌在禽舍环境中广泛存在,以孢子的形式分布于空气中,被禽类吸入后能够到达呼吸道深部和肺,引起呼吸道疾病。目前,烟曲霉菌的研究重点集中在临床病例的诊断、防治以及哺乳动物宿主的致病机制方面,但其感染禽类诱导的先天性免疫尚未见报道,而且,关于烟曲霉菌与细菌和病毒继发感染后的先天性免疫反应亦未见研究。本课题首先建立雏鸡的烟曲霉菌人工感染模型,检测了模型动物靶器官和主要淋巴器官的先天性免疫因子的表达,在此基础上进行了烟曲霉菌人工继发大肠杆菌、H9N2禽流感感染,从发病率、靶器官载菌量(载毒量)以及先天性免疫指标等方面检测真菌感染后,继发感染细菌和病毒的及先天性免疫受体、相关免疫因子的表达。从先天性免疫的角度为真菌免疫以及真菌继发其他病原感染提供一定的参考。本研究分为以下3部分内容:一、雏鸡人工感染烟曲霉菌模型的建立用皮下注射、灌服、气管滴注、气囊注射四种感染途径及分别为0.1m L、0.5 m L、1.0 mL的剂量感染14日龄雏鸡,通过临床症状、剖检变化和死亡率,确定雏鸡人工感染烟曲霉菌的最佳感染途径为胸部气囊注射,最佳感染剂量为0.1mL浓度为107CFU/mL的孢子悬液,成功建立雏鸡人工感染烟曲霉菌模型。二、雏鸡感染烟曲霉菌后诱发的先天性免疫反应为阐明雏鸡感染烟曲霉菌过程中诱导的先天性免疫反应,利用荧光定量PCR法检测肺、脾中四种Toll样受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR7)、6种细胞因子(Cxcl-8、IL-6、IFN-α、IFN-β、TNF-α)和2种主要组织相容性复合体(MHC-I、MHC-Ⅱ)在mRNA水平的表达。将30只14日龄SPF雏鸡随机分为两组:烟曲霉菌感染组和试验对照组,分别在感染后第1、3、5、7天取两组的脾、肺组织。结果表明,3dpi时肺、脾中TLR1、TLR2、TLR7的表达显著高于对照组(p<0.05);Cxcl-8、IL-6、IFN-α均在3dpi肺、脾中上调显著(p<0.05),其中,Cxcl-8在肺中上调倍数最大,可达到33.9倍。5dpi时肺、脾中MHC-I和MHC-Ⅱ的表达显著高于对照组(p<0.05),MHC-I的上调倍数可达到21.7倍。由此可以看出,TLR1、RLR2、TLR7在识别烟曲霉菌过程中发挥重要作用,Cxcl-8和MHC-I也能起到主要的效应能力。三、雏鸡烟曲霉菌继发感染大肠杆菌、H9N2的研究及其诱导的先天性免疫反应应答利用平板计数法对雏鸡烟曲霉菌继发感染大肠杆菌及大肠杆菌单纯感染时心、肝、脾内的细菌含量进行检测。结果显示,同时间段内继发感染组在三种组织中的细菌含量均显著高于单纯感染组(p<0.05)。其中,继发感染第1天,脾内的大肠杆菌含量最高,可达到106 CFU/g,与单一感染组相比差异显著(p<0.05);继发感染第2天,肝内的细菌含量达到109 CFU/g,显著高于单纯感染组(p<0.05)。此外,利用荧光定量PCR法,检测雏鸡继发感染组及单纯感染组,心、脾中的先天性免疫反应。2dpi时,继发感染组心内TLR4、IFN-β的表达量均显著高于单纯感染组(p<0.05);继发感染组脾内TLR4、TLR2、IL-1β的表达量均显著高于单纯感染组(p<0.05)。结果表明,宿主受到烟曲霉菌继发大肠杆菌感染时,TLRs及细胞因子更容易被激活。采用红细胞血凝效价检测方法对烟曲霉菌继发感染H9N2组及单纯感染H9N2时肺组织内的毒力效价进行检测。结果显示,继发感染组毒力效价均高于单纯感染组的病毒毒力效价。在研究雏鸡烟曲霉菌继发感染H9N2及单纯感染H9N2时诱导的先天性免疫反应中,2dpi时继发感染组雏鸡在肺和脾中TLR3、TLR7、IL-1β的表达量均比单纯H9N2感染组显著上升(p<0.05)。其中,TLR3和TLR7在两组雏鸡的肺中表达趋势相似,起初的表达量不明显,随着时间的推移而逐渐上调。3dpi时继发感染组脾、肺中IFN-β的表达量达到峰值,且差异显著(p<0.05)。由此看出,宿主先受到烟曲霉菌感染,H9N2更易入侵机体,引发的TLRs及细胞因子应答更强烈。本实验初步研究了雏鸡受到烟曲霉菌感染后诱导的先天性免疫反应,烟曲霉菌继发感染大肠杆菌、H9N2的研究,为霉菌固有免疫的深入研究做了铺垫。