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[目的]低剂量辐射下PI3K/AKT/p53通路对A549和XWLC-05细胞放射超敏感性、细胞凋亡及相关基因、蛋白表达的影响。[方法]1、查找Genbank中wt-p53基因的序列,设计相应引物,构建野生型p53(wt-p53)慢病毒载体,将慢病毒载体及空载体转染入XWLC-05和A549细胞中。2、用DNA损伤剂阿霉素培养细胞24小时,荧光定量PCR和western-bloting判断p53的表达情况和功能状态。3、用50 μmol/L LY294002选择性抑制剂处理培养XWLC-05和A549细胞24小时,western-bloting检测PI3K/AKT通路抑制情况,以PI3K下游AKT和磷酸化AKT的蛋白表示。4、以不同剂量 x 线(0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0Gy)分别照射 LY294002处理组、野生型p53转染组以及LY294002处理+野生型p53转染组细胞。克隆形成实验看各组细胞的的存活情况,并拟合出细胞存活曲线,比较两种细胞之间的HRS差异性。5、以部分x线(0、0.2、0.5、1.0Gy)照射LY294002处理组、野生型p53转染组以及LY294002处理+野生型p53转染组细胞,检测各组细胞凋亡情况。6、用Western Bloting检测有无PI3K抑制和野生型p53转染时,XWLC-05和A549细胞在不同剂量x线(0、0.2、0.5、1.0Gy)照射下PI3K/AKT/p53通路活化、细胞凋亡及相关基因、蛋白的表达。[结果]1、构建的载体转染XWLC-05和A549细胞:构建的慢病毒载体携带野生型p53基因和绿色荧光蛋白基因(GFP),空载体不携带野生型p53基因、携带绿色荧光蛋白基因(GFP)。转染后72小时,在荧光显微镜下可见绿色荧光,分析后XWLC-05细胞的转染效率为92%,A549细胞的转染效率为96%。转染细胞分别命名为A549-pNeo、A549-wtp53、XWLC-05-pNeo、XWLC-05-wtp53。2、外源性野生型p53基因功能检测:wt-p53基因转染两种细胞后,需在细胞内表达才能发挥作用。RT-PCR检测XWLC-05和A549转染细胞中p53、p21基因表达情况,结果显示:转染后的XWLC-05细胞的p53表达量比母本XWLC-05细胞和转染空载体的XWLC-05细胞都有所升高;转染后A549细胞的p53表达量比母本A549细胞和转染空载体的A549细胞明显升高,转染野生型p53基因的两种细胞的p21表达量明显比母本细胞和对照组高。Western Bloting结果显示:转染外源性野生型p53基因且经DNA损伤剂阿霉素处理后的A549和XWLC-05细胞,p53和p21蛋白表达均上调,表明wt-p53基因在细胞内获得稳定表达,且XWLC-05细胞p53功能异常。3、LY294002选择性抑制PI3K:使用50 μ mol/L LY294002选择性抑制剂处理培养两种细胞24小时后,各组细胞间总AKT蛋白表达量基本不变,以总AKT蛋白作为内参照,加药组XWLC-05细胞的pAKT380,pAKT473蛋白表达明显下降,加药组A549细胞的pAKT380,pAKT473蛋白表达也明显下降;且两种细胞对照组与加药组比较发现:XWLC-05细胞灰度值差值均比A549细胞要大,说明同一浓度的抑制剂下XWLC-05细胞没有A549细胞敏感。4、克隆形成显示:XWLC-05对照组细胞和A549对照组细胞在加入特异性选择抑制剂后存活都下降,低剂量下放射敏感性增加。转染了野生型p53的细胞较对照组细胞的存活分数降低,肉眼可见克隆团明显减少,低剂量下放射敏感性增加。转染了野生型p53基因且加LY294002选择性抑制剂的细胞存活分数显著降低,比转染组和加药组的都要低,低剂量下放射敏感性增加。XWLC-05细胞和A549细胞相比存活分数计较低。5、各组细胞凋亡情况显示:6MV-X线照射LY294002处理组、野生型p53转染组以及LY294002处理+野生型p53转染组细胞,24h后用Hoechst 33342荧光染色和流式细胞仪检测各组细胞凋亡。对A549细胞而言,在各低剂量照射下,加LY294002处理组凋亡率比A549对照组高,野生型p53转染组凋亡率比A549对照组高,LY294002处理+野生型p53转染组细胞的凋亡率比A549细胞对照组高,且是各组中凋亡率最高的。同样的,在各低剂量照射下,XWLC-05细胞加LY294002处理组凋亡率比对照组高,野生型p53转染组凋亡率比对照组高,LY294002处理+野生型p53转染组细胞的凋亡率比对照组高,且是各组中凋亡率最高的。6、PI3K/AKT/p53通路和细胞凋亡相关蛋白表达情况:就两种对照组细胞加ly294004而言,PI3K/AKT通路受到抑制,pAKT的表达降低,pMDM2的表达也是降低的,P53表达升高,p21、caspase3的表达也升高;就对转染了外源性野生型p53的两组细胞而言,p53的表达明显升高,p21、caspase3的表达也显著升高,总MDM2、pMDM2的表达明显升高,pAKT表达降低。[结论]1、XWLC-05和A549细胞转染外源性wt-p53基因后,低剂量放射超敏感性增强,细胞凋亡率增加,且两细胞存在差异。2、PI3K/AKT/p53信号通路可能通过调控两细胞的凋亡从而影响低剂量放射超敏感性