基于一致性共表达网络分析和机器学习模型探究乙烯调控猕猴桃果实细胞壁降解机制

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细胞壁降解与重塑是果实成熟过程中引起软化的关键因素,乙烯对于大部分果实的细胞壁降解具有显著的促进作用。为了探究果实采后乙烯响应以及细胞壁代谢机制,以猕猴桃果实为材料,利用乙烯处理后的果实与乙烯处理中(24 h)的果实,开展生理生化研究及转录组测序,通过改进后的一致性共表达网络分析方法(CCNA,consensus co-expression network analysis)与机器学习(ML,machine learning)模型,结合分子生物学研究,解析了乙烯处理后细胞壁降解引起的果实软化调控机制,构建了乙烯处理过程中的时间响应模型并预测了乙烯响应的层级级联调控机制。主要研究结果如下:1.数据分析方法的改进。通过引入外部生理数据(包括硬度、纤维素、半纤维素、水溶性果胶、共价结合型果胶、离子型果胶)将CCNA与权重基因共表达网络分析(WGCNA,weighted gene co-expression network analysis)结合,聚类到85个一致性cluster,预测得10个候选基因,包括4个转录因子(Ad ZAT5,Ad DOF3,Ad NAC083,Ad MYBR4)和6个细胞壁代谢相关结构基因(Ad GAL1,Ad MAN1,Ad PL1,Ad PL5,Adβ-Gal5,Ad PME1)。通过相关性分析对候选基因间的调控关系进行了预测。2.明确了乙烯处理结束后果实贮藏期间Ad ZAT5通过调控Ad PL5和Adβ-Gal5,影响猕猴桃果实后熟软化。烟草双荧光素酶体系证明锌指蛋白转录因子(Ad ZAT5)对果胶裂解酶基因(Ad PL5,pectate lyase)和β-半乳糖苷酶基因(Adβ-Gal5,β-galactosidase)的启动子具有正向调控效应,凝胶迁移实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay)进一步证明了Ad ZAT5可与Ad PL5和Adβ-Gal5启动子区的GAGGGAGAAGAGAAGACAA和CTTAGTCAGCCTCCTCCGC直接结合。亚细胞定位实验证明了Ad ZAT5与大部分转录因子类似,定位于细胞核。通过猕猴桃果实的瞬时过表达实验,证明了Ad ZAT5对Ad PL5和Adβ-Gal5表达的果实内调控效应。3.预测了乙烯处理进行过程中的快速响应元件及基因分析。利用乙烯处理过程的密集时间点取样,测定了果实硬度、可溶性固形物、细胞壁物质、水溶性果胶、共价结合型果胶和离子型果胶的含量并进行转录组测序。利用随机森林模型(RF,random forest)表征了特征的假定顺式作用元件(p CREs,putative cis-regulatory elements)。CCNA分析结果与RF表征结果联合,预测了三个乙烯初期(0-2 h)响应元件,分别为TACGCG、AACGCG、ACGCGG。同时预测了早期(0-8 h)、中期(10-12 h)、晚期(16-24 h)三个不同响应阶段下的转录因子与软化相关结构基因,并提出了在时间响应模型下的不同基因间层级级联调控模式。
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