磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）是真核生物膜系统中最丰富的一类磷脂,在维持膜结构的完整性及其功能方面起重要作用,并且参与细胞生长分化、物质代谢、信号识别与传导、细胞自噬、细胞周期等多种生命活动。PC合成主要通过两条途径:磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）甲基化途径和CDP-胆碱（CDP-Choline）途径（又称Kennedy途径）。迄今,对真菌PC合成途径的研究主要集中在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,在植物病原真菌中尚未有系统的研究报道。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的水稻稻瘟病（rice blast）是危害水稻生产最严重的病害之一,深入了解稻瘟病菌致病分子机理不仅有利于稻瘟病的防治,而且对认识其他植物病原真菌的致病机理也具有重要的借鉴意义。本文主要研究了稻瘟病菌PE甲基化途径的甲基转移酶编码基因MoCHO2和MoOPI3、CDP-Cho途径的关键限速酶编码基因MoPCT1以及磷脂代谢转录调控因子基因MoOPI1的生物学功能,主要研究结果如下:1.PE甲基化途径对稻瘟病菌生长和产孢至关重要,并可通过影响孢子形成阻断病害循环。1)MoCHO2和MoOPI3对稻瘟病菌生长和产孢至关重要。敲除突变体ΔMocho2和ΔMoopi3在CM培养基上的菌落径向生长速率与野生菌株类似,但二者几乎不形成气生菌丝、不产孢;而在MM培养基上,ΔMocho2和ΔMoopi3几乎不生长;2)MoCHO2和MoOPI3不影响分生孢子致病性。用PC诱导产生的ΔMocho2和ΔMoOpi3分生孢子分别接种寄主,二者均可致病,但用CM菌丝块接种寄主时二者均表现为不致病,说明MoCHO2或MoOPI3的缺失并不影响稻瘟病菌分生孢子致病性,但是可以通过影响孢子形成阻断病害循环;3)PE甲基化途径的阻断并不影响营养丰富条件下稻瘟病菌PC含量。在CM中外源添加PC对ΔMocho2和ΔMoopi3突变体的表型恢复作用十分有限,而ELISA检测结果显示,在CM条件下ΔMocho2和ΔMoopi3的PC含量与野生型无显著差异;4)MoOpi3在PE甲基化途径中作用于Mo Cho2的下游。外源添加PE甲基化途径第一步甲基化反应产物磷脂酰一甲基乙醇胺（phosphatidyl-mono-methylethanolamine,PMME）后,ΔMocho2恢复生长,而ΔMoopi3则不能;另外,在ΔMocho2中过表达MoOPI3能够部分恢复ΔMocho2的表型缺陷。上述实验结果说明MoOpi3作用于Mo Cho2下游。2.CDP-Cho途径的关键限速酶编码基因MoPCT1对稻瘟病菌的营养生长、产孢、附着胞膨压积累及致病性均起重要作用,且MoPct1与细胞自噬、组蛋白H3甲基化修饰等过程有关。1)MoPct1在稻瘟病菌营养生长和产孢中具有重要作用。与野生型Guy11相比,ΔMopct1在CM或MM培养基上的生长速率显著下降且产孢显著减少;2)MoPct1是稻瘟病菌致病性所必需的。孢子喷雾接种实验显示,ΔMopct1突变体对大麦和水稻的致病力均显著下降,且在划伤的大麦叶片上ΔMopct1亦不能侵染;3)MoPct1与稻瘟病菌附着胞膨压的积累有关。在1M甘油处理下,ΔMopct1突变体附着胞塌陷率显著高于野生型,说明ΔMopct1附着胞膨压下降,MoPCT1的缺失影响了稻瘟病菌附着胞膨压的积累;4)MoPct1定位于细胞核。通过荧光显微观察,发现MoPct1-GFP融合蛋白定位于细胞核。进一步将MoPct1核定位信号NLS缺失后,MoPct1ΔNLS-GFP突变体的荧光信号弥散于细胞质,但突变体致病性并未受到影响;5)MoPct1参与了稻瘟病菌细胞自噬水平的调控。ΔMopct1在营养丰富条件下自噬水平升高,自噬相关基因表达量升高,说明MoPct1负调控稻瘟病菌的自噬;6)外源添加PC不能恢复ΔMopct1的表型缺陷,PE甲基化途径对突变体的PC合成可能发挥补偿作用。外源添加PC或CDP-Cho均不能恢复ΔMopct1的生长、产孢和致病性等表型缺陷,说明ΔMopct1的表型缺陷可能并非由于缺乏PC引起。相反,ELISA检测结果显示ΔMopct1中PC含量高于野生型;进一步的q RT-PCR结果显示,MoPCT1的缺失导致PE甲基化途径相关基因MoCHO2、MoOPI3以及上游PE合成相关基因MoPSD2表达量显著上升,说明突变体可能通过PE甲基化途径的激活对CDP-Cho途径进行补偿;7)MoPct1参与甲硫氨酸代谢循环、组蛋白H3甲基化和一些关键致病相关基因的转录调控。q RT-PCR实验结果显示敲除MoPCT1导致稻瘟病菌胞内甲硫氨酸代谢循环的相关基因高表达,Western blot结果显示,在CM条件下,ΔMopct1突变体中组蛋白H3多个甲基化位点的甲基化水平升高。对野生型Guy11和突变体ΔMopct1进行RNA-Seq分析,发现MoPCT1的缺失会引起稻瘟病菌转录组表达水平的变化,影响细胞代谢等过程中一些关键致病相关基因的转录。3、MoOpi1负调控磷脂代谢相关基因的表达,在稻瘟病菌产孢、附着胞形成及侵染过程中起到重要作用。1)MoOPI1在稻瘟病菌产孢和孢子形态建成中起重要作用。与野生型Guy11相比,ΔMoopi1产孢量显著下降,且孢子形态异常的比例高于野生型;2)MoOPI1的缺失影响稻瘟病菌致病性。孢子喷雾接种实验表明ΔMoopi1对寄主的致病力显著下降,且在划伤的大麦叶片上也不能形成侵染;3)MoOPI1在稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成及膨压积累过程中起到重要作用。ΔMoopi1的孢子萌发率、附着胞形成率和附着胞膨压均显著下降;4)MoOPI1与稻瘟病菌对氧化胁迫和渗透胁迫的响应有关。ΔMoopi1对氧化胁迫的敏感性降低,对高渗透胁迫的敏感性升高;5)MoOPI1与多个稻瘟病菌生长发育和致病相关的通路有关。ΔMoopi1的转录组分析表明MoOPI1与甾醇代谢、过氧化物酶体及脂肪酸代谢、氧化还原酶活性、甘油代谢、细胞壁降解等多种生物过程有关;6)MoOPI1负调控多个磷脂代谢相关基因的表达。MoCHO2、MoOPI3、Mo EKI1、Mo EPT1、Mo CPT1等多个磷脂代谢相关基因在ΔMoopi1突变体中上调表达。