普瑞巴林安全性高、耐受性好,是新一代治疗神经病理性疼痛和癫痫的首选药物。化学-酶法合成普瑞巴林已成为目前研究和开发的热点。其中,(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要中间体,本研究从实验室筛选的能够高效拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)的摩氏摩根菌ZJB09203从发,对该菌株的酯酶进行分离纯化,研究其酶学性质,并尝试探索了基因克隆,为其进一步克隆表达和相关应用提供依据。首先开展了Mogarella morganii ZJB-09203酯酶分离纯化。粗酶液经过硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱层析、DEAE Sephadex A-50阴离子交换和羟基磷灰石Bio-Scale CHT层析后得到了电泳纯的酯酶,酶活收率为6.5%,比活力为15.61 U/mg。SDS-PAGE上显示单一条带,蛋白亚基的分子量为66kDa;通过分子筛层析检测为单一洗脱峰,其表观分子量为68 kDa。进一步研究了该酯酶的酶学性质。发现酶促合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的最适pH为8.9,最适温度为45 ℃,在pH7.0-9.0和45 ℃以下,该酯酶具有良好的稳定性。Ca2+、Cu2+、Mr2+对酶活有一定的促进作用,Co2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Ba2+及EDTA对酶活有较强的抑制作用。以对硝基苯酚酯为底物(C2-C16)的底物特异性研究表明,该酶对C6(4-Nitrophenyl Hexanoate)的活力最高。添加有机溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮使酶活性降低,但选择性仍能保持较高的水平。表面活性剂Tween-20,Tween-80及助溶剂DMSO的添加对酶活有轻微的抑制。Morgarellar morganii ZJB-09203 酯酶水解 CNDE,动力学参数Km和 Vmax分别为 12.14mmol/L 和 29.41 μmol/mg.min。研究了纯酶在不同底物浓度时的反应进程,其中底物浓度60mmol/L时,转化率在反应6h后达到45%,e.e.p为96%。据LC-MS-MS分析比对,酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列为:R.SRDGLTLVSYLTLPR.E。以Morgarella morganii ZJB-09203 基因组为模板,以蛋白肽谱测序结果为依据设计引物,PCR扩增得到了目的基因的部分序列,将PCR产物连接pGEM(?)-T载体并测序得到长度为400 bp左右的核苷酸序列,并通过NCBI中Blast比对,初步验证了其正确性。