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研究背景与目的:肝脏拥有强大的再生能力,切除小鼠2/3的肝脏后,残余肝脏组织可以在10天左右恢复原有体积大小,并且保持肝脏原有功能。肝再生是保障肝脏维持物质合成、毒物代谢的重要保护机制。然而当肝脏遭受到破坏性损伤或者慢性肝损伤时,肝脏再生能力明显降低,无法再通过再生修复自身,最终导致急、慢性肝衰竭。我国拥有世界上最大基数的乙肝及肝癌人群,肝病负担沉重,多种肝病导致的急慢性肝功能不全及肝功能衰竭是临床医生亟待解决的重大难题。研究肝再生的分子调控机制,将为治疗慢性肝炎、肝纤维化、肝衰竭等肝病提供潜在的生物治疗靶点,具有重要的科学及临床意义。Nur77是由NR4A1编码的一种受体蛋白,由于未发现内源性配体,被认为是孤儿核受体,其与Nurr1和Nor1共同组成NR4A核受体家族。NR4A核受体家族在多种组织和细胞的细胞增殖,凋亡和能量代谢中发挥重要的调控作用。已有文献报道,Nurr1在肝大部分切除术后早期呈现显著上调。Nor1及其靶基因CCND1和VCAM-1在肝大部分切除术后细胞增殖阶段表达上调。本课题组前期研究发现Nur77基因敲除小鼠在肝大部分切除(Partial Hepatectomy,PHx)术后肝细胞增殖加速及肝再生进程提前,但肝再生过程中炎症损伤、细胞凋亡显著增加,部分炎症介质、趋化因子的基因表达也显著上调,肝再生是受炎症损伤-修复、增殖-凋亡等多个稳态机制共同调控的复杂而又精准的过程,本课题组推测Nur77在调控肝再生免疫稳态调节中发挥重要作用。本研究利用PHx构建肝再生模型,利用Nur77特异性激动剂Csn-B激活诱导Nur77活性,检测肝组织中炎症因子及炎症相关信号通路分子变化情况,探讨Nur77在肝再生过程中的分子机制。材料与方法:我们将72只8-12周龄C57BL/6小鼠随机均分为3组:假手术组(Sham组)、DMSO组和实验组(Csn-B组),每组24只,在术前30min给Csn-B组小鼠腹腔注射Nur77靶向激动剂Csn-B(13mg/kg,LD50),给Sham组和DMSO组注射同等量的DMSO溶剂,DMSO组和Csn-B组实施PHx手术,在术后3 h、24 h、48 h和72 h收集肝组织,检测各组相应时间点的Nur77表达水平、肝体重比、Ki-67阳性细胞比、KC活化细胞占比、核分裂相占比、IL-6、IL-10、IL-12的m RNA水平及γH2AX、Cleaved Capase3、Cleaved Capase8、细胞周期相关蛋白、磷酸化p65及磷酸化STAT3的蛋白水平。通过检测CCK-8细胞增殖及流式细胞检测细胞周期,研究Nur77激动剂Csn-B及拮抗剂DIM-C-p Ph OH对HL-7702肝细胞和NCTC1469肝细胞的影响。结果:1.通过q RT-PCR和Western blot法检测PHx术后小鼠肝组织Nur77表达,Nur77在Csn-B组和DMSO组PHx术后早期迅速诱导表达,Csn-B组Nur77的m RNA表达水平在3h时是DMSO组的4倍(36.78±2.75 vs 9.56±1.90,P<0.001),在24h时是DMSO组的2.6倍(16.16±2.40 vs 6.12±1.16,P<0.001),而Nur77蛋白表达水平比DMSO组在3h、24h时上调2倍(P<0.001),在48h时Nur77下降至Sham组相近水平。2.PHx术后Csn-B组小鼠相对DMSO组表现出更低的肝体重比,HE组织病理、免疫组化检测Csn-B组小鼠核分裂相、Ki-67阳性细胞占比显著低于DMSO组,Western blot检测Csn-B组小鼠Cyclin D1、Cyclin B、Cyclin E的蛋白表达水平显著低于DMSO组,提示Nur77抑制PHx术后肝细胞增殖及肝再生进程。3.通过免疫组化及Western blot检测γH2AX蛋白表达,Csn-B组小鼠免疫组化γH2AX阳性细胞比例及γH2AX蛋白表达水平显著低于DMSO组,Western blot检测Cleaved Capase3、Cleaved Capase8蛋白表达,Csn-B组小鼠在PHx术后3h、72h的Cleaved Capase3蛋白表达水平显著低于DMSO组小鼠,Cleaved Capase8蛋白表达水平在3h、24h、48h、72h显著低于DMSO组小鼠。HE组织病理检测Csn-B组小鼠肝小叶局灶性坏死灶显著少于DMSO组。4.q RT-PCR检测发现Csn-B组小鼠IL6、IL12表达显著低于DMSO组,而IL12显著高于DMSO组。免疫组化检测发现Csn-B组小鼠在3h、24h的F4/80阳性区域占比显著低于DMSO组,通过Western blot检测发现Csn-B组小鼠的磷酸化NF-κB和磷酸化STAT3蛋白表达水平低于DMSO组,提示Nur77抑制NF-κb/STAT3信号通路受抑制及KC细胞活化。5.通过Nur77激动剂Csn-B和拮抗剂DIM-C-p Ph OH处理HL-7702,NCTC1469两株肝细胞,通过CCK-8检测细胞增殖及流式细胞检测细胞周期,发现Nur77激动剂Csn-B抑制肝细胞的增殖,而拮抗剂DIM-C-p Ph OH促进肝细胞增殖。结论:1.小鼠PHx术后,Nur77在肝再生早期迅速诱导表达,Nur77靶向激动剂Csn-B可显著诱导PHx术后Nur77表达。2.Nur77可以显著抑制PHx术后小鼠肝细胞增殖及肝再生进程。3.Nur77可显著抑制PHx术后小鼠肝组织DNA损伤及细胞凋亡。4.Nur77可能通过抑制PHx术后小鼠肝再生起始阶段NF-κB/STAT3通路和库普弗细胞活化进而抑制肝再生进程。5.Nur77激动剂Csn-B可以抑制肝细胞的增殖,而拮抗剂DIM-C-p Ph OH可以促进肝细胞增殖。