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脓毒症(sepsis)是一种由感染因素诱发、以全身炎症反应为主的综合症,是危重病患者的主要死因之一。目前尚无有效的防治措施!高氧吸入作为一种治疗手段已被广泛应用于临床,但因为氧毒性,其临床应用受限。临床上氧疗多采用小于60%氧浓度。然而,近年来研究发现,100%氧气早期应用可有效保护多种休克动物器官功能,显著提高休克动物存活率。另外,高氧可诱导氧自由基(ROS)的产生,且ROS在脓毒症的病理生理过程中起重要作用。大量的ROS可导致氧化损伤等毒性作用,而最近研究发现适量的ROS对疾病的发生发展具有有利作用。在上述基础上,本研究利用酵母多糖(ZY)诱导的脓毒症模型,首先,探讨100%氧吸入治疗脓毒症的合理方案及其治疗时间窗;其次,研究抗氧化酶及炎症细胞因子在其中的具体作用;最后,观察ROS清除剂对100%氧治疗脓毒症效应的影响,进一步探讨抗氧化酶及炎症细胞因子在其中的作用。第一部分:100%氧吸入治疗脓毒症的合理方案及其治疗时间窗研究方法1.合理100%氧吸入能明显改善脓毒症小鼠脏器功能和生存率雄性ICR小鼠,随机分为10组:“生理盐水+空气”组、“脓毒症+空气”组、“生理盐水+氧气1h,2h,3h,4h”组和“脓毒症+氧气1h,2h,3h,4h”组。腹腔注射1 g/kg ZY诱导脓毒症模型;而生理盐水(NS)对照组动物给予等容积的NS。100%氧治疗为在注射ZY后4h和12h分别给动物100%氧吸入1h,2h,3h或4h;而空气对照组动物吸入空气。通过观察各组动物不同时间点的生存率、血生化参数(cTnI,ALT,AST,Cr及BUN)、器官病理损伤和病理评分、动脉血气和血乳酸指标,判断100%氧吸入对脓毒症动物的合理治疗方案。2.合理100%氧吸入有效治疗脓毒症小鼠的时间窗雄性ICR小鼠,随机分为6组:“脓毒症+空气”组和“脓毒症+氧气4,8,12,16,20”组。各组动物分别腹腔注射1 g/kg ZY造成脓毒症模型。脓毒症+氧气4,8,12,16,20组动物分别在注射ZY后4h,8h,12h,16h和20h开始吸入100%氧3h,间隔8h后再分别给予100%氧吸入3h。观察不同时间点各组动物的生存率及第一次吸氧前、后的动脉血气,判断100%氧吸入对脓毒症动物的治疗时间窗。结果1.合理100%氧吸入能明显改善脓毒症小鼠脏器功能和生存率与生理盐水+空气组比较,脓毒症+空气组动物的器官损伤非常明显,病理评分和血生化参数水平明显增加(P<0.05),动脉血氧分压水平明显下降(P<0.05)、血乳酸水平明显升高(P<0.05)、14d生存率降至10%(P<0.05)。与脓毒症+空气组比较,脓毒症+氧气2h和3h组动物的器官病理损伤明显减轻,病理评分和血生化参数水平下降(P<0.05)、动脉血氧分压水平明显升高(P<0.05)、血乳酸水平明显下降(P<0.05)、14d生存率升至60%-80%(P<0.05),而脓毒症+氧气1h和4h组动物的上述指标无明显变化(P>0.05)。2.合理100%氧吸入有效治疗脓毒症小鼠的时间窗与脓毒症+空气组相比,脓毒症+氧气4,8,12组动物的14d生存率明显提高(P<0.05),动脉血氧分压也显著提高(P<0.05,高于300 mmHg),而脓毒症+氧气16,20组动物的生存率变化不明显(P>0.05)。结论早期合理100%氧吸入可有效减轻脓毒症小鼠的器官损伤,改善其功能和组织氧合,明显提高动物生存率,其治疗时间窗为12h。第二部分:早期合理100%氧吸入对脓毒症小鼠保护作用的机制研究方法1.早期合理100%氧吸入对脓毒症小鼠炎症细胞因子水平和抗氧化酶活性变化的影响雄性ICR小鼠,随机分为10组:实验分组同第一部分方法1。观察注射ZY或NS后24h各组动物血清促炎因子TNF-α,IL-6,HMGB1和抗炎因子IL-10水平以及血清和器官抗氧化酶SOD,CAT,GSH-Px活性的变化。判断炎症细胞因子和抗氧化酶是否参与100%氧吸入对脓毒症动物的保护作用。结果1.早期合理100%氧吸入对脓毒症小鼠炎症细胞因子水平和抗氧化酶活性变化的影响与生理盐水+空气组比较,脓毒症+空气组动物血清促炎因子TNF-α,IL-6,HMGB1水平明显升高(P<0.05)、抗炎因子IL-10水平明显降低(P<0.05)、血清和器官抗氧化酶SOD,CAT,GSH-Px活性明显降低(P<0.05)。与脓毒症+空气组比较,脓毒症+氧气2h和3h组动物血清促炎因子TNF-α,IL-6,HMGB1水平明显下降(P<0.05)、抗炎因子IL-10水平明显升高(P<0.05)、血清和器官抗氧化酶SOD,CAT,GSH-Px活性明显升高(P<0.05),脓毒症+氧气1h和4h组动物的上述指标变化不明显(P>0.05)。结论早期合理100%氧吸入可有效降低脓毒症动物血清促炎因子水平、提高抗炎因子水平,同时可有效改善动物血清和器官抗氧化酶活性,提示100%氧吸入对产生脓毒症的保护作用的部分机制是通过调节炎症细胞因子水平和抗氧化酶活性实现的。第三部分:ROS清除剂预给药可取消100%氧对脓毒症小鼠的保护作用及相关机制研究方法1. ROS清除剂对100%氧治疗脓毒症效应的影响雄性ICR小鼠,随机分为11组:“生理盐水+空气”组、“脓毒症+空气”组、“脓毒症+空气+安慰剂”组、“脓毒症+空气+氧自由基清除剂(N-acetylcysteine (NAC) or Vitamin C (Vit C) or dimethylthiourea (DMTU))”组、“脓毒症+氧疗”组、“脓毒症+氧疗+安慰剂”组和“脓毒症+氧疗+ROS清除剂(NAC or Vit C or DMTU)”组。腹腔注射1 g/kg ZY诱导脓毒症模型,经腹腔注射等容积NS为对照。氧疗组动物在注射ZY后4h和12h分别吸入100%氧3h,而空气组动物吸入空气作为对照。ROS清除剂组动物在氧疗前30 min分别腹腔注射150 mg/kg的NAC、150 mg/kg的Vit C或50 mg/kg的DMTU,而安慰剂组动物在相同时间点分别给予等容积的NS作为对照。观察各组动物不同时间点的生存率、血生化参数(cTnI,ALT,AST,Cr及BUN)、器官病理损伤和病理评分、动脉血气和血乳酸,判断ROS清除剂预给药对100%氧治疗脓毒症效应的影响。2. ROS清除剂预给药可取消100%氧对脓毒症小鼠的保护效应:炎症细胞因子和抗氧化酶的作用雄性ICR小鼠,随机分为11组:实验分组同第三部分方法1。观察注射ZY或NS后不同时间点各组动物血清促炎因子TNF-α,IL-6,HMGB1和抗炎因子IL-10水平以及血清和器官抗氧化酶SOD,CAT,GSH-Px活性的变化,判断炎症细胞因子和抗氧化酶是否在其中发挥作用。结果1. ROS清除剂对100%氧治疗脓毒症效应的影响与脓毒症+空气组相比,脓毒症+氧疗组动物血生化参数水平和器官病理评分均明显下降(P<0.05),动脉血氧分压水平明显升高(P<0.05),血乳酸水平明显下降(P<0.05),14d生存率显著升高(P<0.05)。与脓毒症+氧疗组相比,脓毒症+氧疗+ROS清除剂组动物的血生化参数水平和器官病理评分均明显升高(P<0.05),动脉血氧分压水平明显下降(P<0.05),血乳酸水平明显升高(P<0.05),14d生存率显著下降(P<0.05)。但是,与脓毒症+空气组相比,脓毒症+空气+ROS清除剂组动物的血生化参数水平和器官病理评分均明显下降(P<0.05)动脉血氧分压水平明显升高(P<0.05),血乳酸水平明显下降(P<0.05),14d生存率显著升高(P<0.05)。2. ROS清除剂预给药可取消100%氧对脓毒症小鼠的保护效应:炎症细胞因子和抗氧化酶的作用与脓毒症+空气组相比,脓毒症+氧疗组动物的血清促炎因子TNF-α、IL-6、HMGB1水平明显下降(P<0.05),血清抗炎因子IL-10水平明显升高(P<0.05),血清和器官抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性显著增加(P<0.05)。与脓毒症+氧疗组相比,脓毒症+氧疗+ROS清除剂组动物血清促炎因子TNF-α、IL-6、HMGB1水平明显升高(P<0.05),血清抗炎因子IL-10水平明显下降(P<0.05),血清和器官抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性显著下降(P<0.05)。但是,与脓毒症+空气组相比,脓毒症+空气+ROS清除剂组动物血清促炎因子TNF-α、IL-6、HMGB1水平明显下降(P<0.05),血清抗炎因子IL-10水平明显升高(P<0.05),血清和器官抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性显著增加(P<0.05)。结论ROS清除剂预给药可取消100%氧对脓毒症小鼠的保护作用,说明100%氧释放的ROS参与了其对脓毒症的保护效应;其部分机制是通过取消100%氧对炎症细胞因子水平和抗氧化酶活性的调节作用。小结1.早期合理100%氧吸入可有效改善脓毒症小鼠器官功能,改善组织氧合,明显提高其生存率。2.早期合理100%氧吸入治疗脓毒症小鼠的时间窗为12h。3. 100%氧治疗的部分机制是通过降低脓毒症动物血清促炎细胞因子水平、提高血清抗炎因子水平,以及提高血清及器官抗氧化酶的活性。4. ROS清除剂预给药不是增强而是取消了100%氧对脓毒症动物的保护作用,部分机制是通过取消了100%氧对炎症细胞因子和抗氧化酶的调节作用。