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完带汤是清代名医傅青主创制治疗带下疾病的经典名方。外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是女性常见的下生殖道感染性疾病,根据其典型的临床表现,现代中医学将其归属于“带下病”范畴。通过古代、现代文献梳理,我们提出“完带汤恢复VVC阴道微生态的线粒体保护机制”研究假说,并从微生态-免疫微环境中菌群—线粒体STING信号通路为切入点,结合临床和基础研究,探索完带汤治疗VVC的临床疗效、预防复发及线粒体保护作用机制。第一部分:临床试验研究方法:选择VVC患者70例,随机分为完带汤治疗试验组和氟康唑治疗对照组。分别给予完带汤和氟康唑干预治疗。主要终点指标为临床治愈(Test of cure,TOC)、临床缓解(Clinical improvement,CI)、访视(Follow up,FU);次要终点指标为:真菌学转阴、复发率、阴道菌群、宏基因组学、代谢组学指标、宏基因组学与代谢组学关联性分析、IL-1α、IFN-α、STING、IRF3、MX2水平变化以及线粒体DNA损伤情况和安全性检测。研究结果:(1)治疗组脱落3例,剔除2例;对照组脱落2例,剔除3例。每组共计30例纳入结果分析。(2)主要终点指标结果:完带汤干预治疗2周后,与氟康唑干预治疗比较,第7-14天的临床治愈访视(TOC)数据统计分析结果显示:完带汤组临床治愈为53.3%(16/30),氟康唑组为46.7%(14/30);两组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。第7-14天的临床缓解访视(CI)结果显示:完带汤组在访视时CI为90%(27/30);氟康唑组为76.67%(23/30);两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。完带汤组在FU访视时临床完全缓解为83.33%(25/30),氟康唑组访视时临床完全缓解率为53.33%(16/30),差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)次要终点指标结果:完带汤组在TOC访视时93.33%(28/30)的患者达到真菌根除;氟康唑组为83.33%(25/30)(25/30),差异没有统计学意义(P>0.05)。在第3个月随访时,完带汤组复发率为6.67%(2/30),氟康唑组复发率为43.33%(13/30),差异具有统计学意义(P<0.01)。阴道菌群结果显示:患者经过氟康唑、完带汤治疗后,在完带汤组阴道菌群中L.gasseri、L.jensenii等阴道优势菌群的丰度较治疗前提高;而在氟康唑组治疗后阴道菌群中PrevortellabiviagPrevotella、AtopobiumbaginaegAtopobium 等厌氧菌菌种水平提高。宏基因组学结果显示:完带汤组治疗后阴道微生物群落为CSTⅡ、Ⅴ型(L.gasseri、L.jensenii为主);氟康唑组治疗后阴道微生物群落为CSTⅢ、Ⅳ型(L.iners、Anaeroboc organism为主)。KEGG功能富集分析结果显示:在假丝酵母菌的细胞周期、减数分裂功能上,完带汤组在细胞周期及减数分裂的信号通路上显著性高于氟康唑组(P<0.05)。CAZy功能分析结果显示:在药物耐药及抵抗功能基因上,完带汤组显著性高于氟康唑组(P<0.05)。代谢组学结果:在治疗前后,完带汤组差异代谢物共有59个,而氟康唑组为43个。但在治疗后,完带汤组与氟康唑组组间的差异代谢物增加到120个。在治疗前后,氟康唑组治疗后上调了 40个差异代谢物,下调了 3个差异代谢物。完带汤组上调了50个差异代谢物,下调了 9个差异代谢物。两组间比较,治疗后上调了 53个代谢物,下调了 67个代谢物。差异代谢物KEGG代谢通路富集分析结果显示:完带汤可能在改善阴道局部α亚麻酸、甘油磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、花生四烯酸等代谢通路方面显著优于氟康唑。宏基因组学与代谢组学关联性分析结果显示:组间在治疗前后的前10种差异菌种、差异代谢物,按相关性数值排序,每一种差异代谢物相关性的前5种差异菌种为 Lactobacillusgasseri、Ureaplasmaparvum、Ureaplasmaurealyticum、Lactobacillusparagasseri、Lactobacillusjensenii。每一种菌种相关性的前 5 种差异代谢物为 Dilauryl 3,3 ’-thiodipropionate、Spirolide E、1-O-alpha-D-glucopyranosyl-1,2-nonadecandiol、DG(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0)、(25S)-5alpha-cholestan-3beta,4beta,6alpha,8beta,15alpha,16beta,26-heptol。基于差异菌种与差异代谢物的关联分析结果,对差异代谢物和基因进行KEGG信号通路富集分析。结果显示:氟康唑组治疗前后富集到的差异的信号通路为:NOD-like receptors(NOD样受体)信号通路、biosynthesis of amino acids(氨基酸的生物合成)信号通路。而在治疗后的组间差异基因和代谢物的KEGG富集信号通路中,富集出以下4种信号通路:pentose and glucuronate interconversions(戊糖和葡萄糖醛酸相互转化)信号通路、glycerophospholopid metabolism(甘油磷脂代谢)信号通路、phenylpropanoid biosynthesis(苯丙素合成)信号通路、biosynthesis of animo acids(氨基酸合成)信号通路。完带汤和氟康唑均可提高阴道微环境中的免疫因子IFN-α,两组之间差异没有统计学意义。完带汤组在降低阴道局部促炎因子IL-1α方面,优于氟康唑组,差异具有统计学意义(P<0.05);氟康唑组对线粒体具有加剧损伤的作用,完带汤组并没有表现出加剧线粒体损伤的作用;完带汤组治疗后STING、IRF3、MX2含量均显著升高(P<0.05,P<0.01)。氟康唑组治疗后仅有STING含量升高(P<0.01),对IRF3、MX2含量变化影响不明显(P>0.05)。氟康唑组、完带汤组的VVC患者丙氨酸氨基转移酶、血清天门冬氨酸氨基转移酶、尿素氮、肌酐测定结果均未提示有异常结果,也均未出现药物不良反应。研究结论:(1)完带汤组与氟康唑组相比,在临床疗效、减轻或缓解VVC症状体征、防止VVC复发、恢复阴道微生物群落结构方面优于氟康唑组;(2)完带汤可恢复VVC患者阴道微生态;(3)完带汤改善阴道微生态可能与影响阴道局部甘油磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等代谢通路有关;(3)完带汤恢复VVC患者阴道微生态,减轻炎症,可能与线粒体保护STING信号通路的激活有关。第二部分动物实验研究方法:建立VVC小鼠动物模型,分别给予完带汤高、中、低、剂量及氟康唑(阳性对照)、抗生素干预,结合阴道组织HE染色、阴道组织上皮细胞电镜检测、阴道组织细胞凋亡检测、阴道灌洗液炎症因子IL-6、IL-8、Il-10、线粒体DNA损伤标志物、STING信号通路相关因子检测,重点从STING信号通路角度探索完带汤治疗VVC的线粒体保护机制。研究结果:(1)HE染色结果显示:模型组小鼠VVC造模成功,主要表现为阴道粘膜上皮内较多的中性粒细胞浸润,部分表层上皮细胞坏死脱落,上皮下的固有层内有较多的中性粒细胞浸润,固有层内血管轻度扩张充血,部分区域间质明显水肿,组织结构疏松;中剂量组改善VVC炎症作用更为显著。(2)电镜结果显示:模型组小鼠阴道上皮细胞线粒体损伤程度相对较高,线粒体损伤较重,严重肿胀,体积变大,嵴断裂缺失,部分空泡化,少量膜破损;高剂量组、低剂量组小鼠阴道上皮细胞线粒体损伤程度居中,部分线粒体中度或重度肿胀,基质局部溶解,嵴部分缺失,局部空泡化,部分线粒体轻微或无明显肿胀,基质较均匀,嵴排列整齐;阳性对照组、抗生素组、正常组小鼠阴道上皮细胞线粒体损伤程度相对较低,少部分轻度或轻微肿胀,基质不均或变浅,嵴少量断裂,部分嵴排列整齐;中剂量组小鼠阴道上皮细胞部分线粒体结构相对较好,未见明显肿胀,基质均匀,嵴排列整齐,偶见个别线粒体中度肿胀,嵴少量断裂。(3)凋亡细胞TUNEL染色结果:模型组凋亡细胞数目增加,与正常组比较,P<0.01;阳性对照组、高剂量组、低剂量组凋亡细胞数目虽然减少,但与模型组比较,P>0.05;阳性对照组与高剂量组、低剂量组比较,差异没有统计学意义,P>0.05。抗生素组、中剂量组,与模型组比较,P<0.05。抗生素组与中剂量组比较,差异没有统计学意义,P>0.05。(4)阴道灌洗液炎症因子检测结果:模型组小鼠细胞因子IL-6、IL-8、IL-10含量升高,与正常组比较,P<0.0001;阳性对照组、抗生素组、高剂量组、中剂量组、低剂量组均可降低IL-6、IL-8、IL-10的含量,与模型组比较,P<0.01,或P<0.05;阳性对照组、抗生素组与中剂量组比较,差异没有统计学意义,P>0.05;中剂量组与高剂量组、低剂量组比较,P<0.05。5)线粒体损伤标志物8-OHDG含量检测结果:模型组线粒体损伤标志物8-OHDG含量显著升高,与正常组比较,P<0.0001;阳性对照组、抗生素组、高剂量组、中剂量组、低剂量组均可降低8-OHDG含量,与模型组比较,P<0.01;阳性对照组与中剂量组比较,差异没有统计学意义,P>0.05。中剂量组和低剂量、高剂量组比较,P<0.05。(6)STING信号通路相关因子检测结果:模型组阴道灌洗液线粒体STING信号通路相关因子Ⅰ-IFN、STING、IRF3、MX2 含量均低于正常组,P<0.01。抗生素组 Ⅰ-IFN、STING、IRF3、MX2含量和模型组比较,差异没有统计学意义,P>0.05。阳性对照组Ⅰ-IFN、STING含量和模型组比较,P<0.05。高剂量组、中剂量组、低剂量组均可升高Ⅰ-IFN、STING、IRF3、MX2的含量,与模型组比较,P<0.01或P<0.05;高剂量组、低剂量组与阳性对照组比较,差异没有统计学意义,P>0.05。中剂量组与阳性对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05;中剂量组与高剂量组、低剂量组比较,P<0.05。研究结论:(1)完带汤中剂量组改善VVC炎症作用更为明显。(2)完带汤中剂量对VVC线粒体保护作用更好;(3)完带汤中低剂量对STING信号通路的激活作用更强。