【摘 要】
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杜仲是我国特有的经济树种,拥有多种用途。叶片是杜仲资源可持续利用的最佳原材料,杜仲叶片生长发育相关基因的研究对杜仲资源的开发利用具有重要意义。生长素响应因子（Auxin response factor,ARF）是一类能够在叶片生长发育过程中发挥巨大调控作用的转录因子。利用杜仲全基因组测序数据,挖掘杜仲ARF基因家族成员,筛选调控杜仲叶片生长发育的ARF基因进行功能研究,不仅能够填补杜仲ARF基因研
【基金项目】
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国家林业局林业公益性行业科研专项,杜仲重要性状的遗传机制与分子育种基金（编号:2013KTCL02-03）；
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杜仲是我国特有的经济树种,拥有多种用途。叶片是杜仲资源可持续利用的最佳原材料,杜仲叶片生长发育相关基因的研究对杜仲资源的开发利用具有重要意义。生长素响应因子（Auxin response factor,ARF）是一类能够在叶片生长发育过程中发挥巨大调控作用的转录因子。利用杜仲全基因组测序数据,挖掘杜仲ARF基因家族成员,筛选调控杜仲叶片生长发育的ARF基因进行功能研究,不仅能够填补杜仲ARF基因研究的空白,为杜仲其他基因家族的研究提供借鉴,还能为杜仲叶片生长性状的遗传改良奠定基础。本研究利用杜仲全基因测序数据,鉴定杜仲ARF基因家族的成员,结合杜仲小RNA测序和转录本全长测序信息,通过表达量分析对杜仲ARF基因家族成员进行功能预测,从中选出可能调控杜仲叶片生长发育的关键基因EuARF19.2,构建EuARF19.2植物表达载体,进行拟南芥的遗传转化验证其功能,最后优化杜仲愈伤组织再生体系,构建农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化系统,进行EuARF19.2在杜仲的遗传转化。主要研究结果如下:（1）在杜仲基因组中共鉴定出18个杜仲ARF基因,这些EuARFs可以归属到5个亚族中,同亚族的EuARFs蛋白具有相似的理化性质与蛋白结构,可能行使相似的功能。EuARFs的表达分析显示EuARFs在正常生长条件下不同发育阶段（幼嫩和成熟）的器官（根、茎和叶）中均有表达,其中EuARF19.2在叶片中的表达显著高于其他EuARFs,说明EuARF19.2对杜仲叶片生长可能具有重要的调控作用。（2）EuARF19.2表达量与植株叶面积表型的关联性分析显示,EuARF19.2在叶片发育早期的表达与叶片成熟后的叶面积显著正相关,表明EuARF19.2能够调控叶片形态发育,促进叶面积增大。IAA处理下带芽茎段叶片的EuARF19.2表达量分析显示,添加外源IAA,EuARF19.2上调表达,表明EuARF19.2能够响应外源IAA。（3）获得了EuARF19.2的cDNA全长序列,构建了pBI121-EuARF19.2植物表达载体,进行了农杆菌介导的拟南芥遗传转化,通过卡那霉素（Kanamycin,Kan）筛选与PCR验证,最终筛选获得转EuARF19.2 T3代阳性拟南芥植株。T3代阳性转基因植株的表型分析证明EuARF19.2的表达对拟南芥的叶面积增大有促进作用。（4）优化了杜仲叶片愈伤组织再生体系,筛选获得愈伤组织诱导最适导培养基为MS+8.1μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA,诱导率达到100±0%;愈伤组织继代增殖的最适培养基为MS+0.27μmol·L-1 NAA+6.7μmol·L-1 6-BA,增殖系数为304±36%,褐化率为16±4%,继代周期为18～20d;不定芽诱导最适合培养基为3/4MS+0.27μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA,不定芽诱导率为83±10%;芽苗复壮最适培养基为3/4MS+0.054μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA,芽生长长度为2.47±1.33cm。（5）以GUS瞬时表达率为标准评价了转化因子对农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化效率的影响,获得了最适转化因子组合为:预培养5 d、侵染时间10 min和共培养3 d,筛选培养基为3/4MS+0.054μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA+200mg·L-1Cef+70 mg·L-1Kan。通过获得的遗传转化体系,进行了pBI121-EuARF19.2的遗传转化,获得了4个转pBI121-EuARF19.2抗性芽。PCR分析和GUS组织化学染色都表明目的基因已整合到抗性芽基因组中,表型观察与EuARF19.2表达量的分析推测EuARF19.2的过量表达能够增大杜仲叶面积。
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