hsa_Circ_0001785通过靶向吸附miR-942上调SOCS3在体内外抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:duanxinyu0056
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研究背景及目的:乳腺癌(Breast cancer,BC)是全球女性最常见的癌症,其发病率已经上升为全球第一位。乳腺癌的发病机理复杂,其分子特征和临床表现形式多样,患者的预后差异很大。因此,研究乳腺癌的分子机制,寻找乳腺癌早期诊断标志物和新的治疗靶点具有重要意义。环状RNA(CircRNA)是一类广泛表达的非编码RNA,近年研究发现其在肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用。值得注意的是,先前研究发现乳腺癌患者外周血中的hsa_Circ_0001785显著降低,其表达水平与组织学肿瘤分级、肿瘤淋巴结转移(TNM)阶段和淋巴结转移高度相关,这些发现表明Circ_0001785在乳腺癌中可能具有更好的诊断价值和更高的诊断准确性。目前,Circ_0001785在乳腺癌中的详细作用和机制尚未明确。本研究的目的是在体内和体外水平研究hsa_Circ_0001785对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其潜在的分子机制。研究方法及内容:1.通过 qRT-PCR 检测 hsa_Circ_0001785 在五种 BC 细胞系(T47D,MCF-7,MDA-MB-453,MDA-MB-231 和 BT-549)和一种正常乳腺细胞系(MCF-10A)中的表达情况。筛选表达差异最大的2种细胞系进行后续实验。经过RNaseR处理证实Circ_0001785是环状RNA。构建了 Circ_0001785的过表达质粒(pcDNA-Circ_0001785),并通过qRT-PCR验证其过表达效率。2.通过体外实验研究hsa_Circ_0001785在乳腺癌细胞中的生物学功能。通过CCK-8、克隆形成、划痕实验和Transwell实验、蛋白质印迹法(western blot)分析hsa_Circ_0001785对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3.构建接种T47D细胞和MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下肿瘤模型进行体内实验。每天监测小鼠体重和肿瘤体积,处理14d后,解剖荷瘤小鼠的肿瘤组织,观察hsa_Circ_0001785对肿瘤异种移植的裸鼠体内成瘤的影响。通过蛋白质印迹法(western blot)分析测定相关蛋白(KI67、PCNA、MMP7和MMP9、SOCS3)在肿瘤组织中的表达。4.检测Circ_0001785的亚细胞定位。通过对CIRCinteractome数据库的分析,评分标准(参考背景+分数>90),选取与circ_0001785结合的前5个miRNA进行验证。通过荧光素酶报告基因技术及western blot分析筛选出目标miRNA。qRT-PCR及体内实验研究circ_0001785和miR-942之间的表达关系。通过RNA免疫沉淀(RIP)和双荧光素酶报告基因检测法确定hsa_Circ_0001785在乳腺癌中起竞争性内源RNA(ceRNA)的作用。5.构建miR-942mimic,通过qRT-PCR测定miR-942过表达和抑制的转染效率。通过CCK-8、克隆形成分析、划痕实验、Transwell实验和westernblot检测了 miR-942在转染了 Circ_0001785的BC细胞中的生物学功能。通过小鼠异种移植实验和westernblot研究了体内circ_0001785对miR-942的影响。6.TargetScan数据库预测SOCS3是miR-942的靶基因,qRT-PCR及westernblot研究SOCS3的表达。通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-942和SOCS3之间的结合关系。RIP实验探索circ_0001785的ceRNA功能。Westernblot分析细胞及肿瘤组织中circ_0001785和miR-942对SOCS3表达的影响。结果:1.Circ_0001785在乳腺癌细胞中低表达,Circ_0001785过表达抑制乳腺癌细胞及增殖、迁移和侵袭,同时抑制乳腺癌在体内的进展。2.Circ_0001785主要存在于细胞质中,可通过竞争性地结合miR-942在乳腺癌中起ceRNA的作用。3.Circ_0001785通过靶向miR-942调节乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭;抑制乳腺癌在体内的进展;4.Circ_0001785通过抑制miR-942调节其靶基因SOCS3的表达。结论:环状RNA hsa_Circ_0001785通过调节miR-942/SOCS3信号轴抑制BC细胞的增殖、迁移和侵袭。
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