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研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是以对称性关节炎为主要临床表现的慢性系统性自身免疫性疾病。关节的炎症活动最终会导致患者出现关节功能障碍,致畸致残。RA的主要病理特征是:关节滑膜增生,血管新生和血管翳形成,继而侵蚀关节,最终结局是关节破坏和畸形。尽管RA的发病机制至今尚未完全清楚,但可以明确的是,在RA发生发展过程中,滑膜成纤维细胞（fibroblast 1ike synoviocyte,FLS）异常增生、迁移和侵袭是RA疾病进展的重要病理改变。环状RNA（circular RNAs,circRNA）是新型的非编码RNA,具有稳定、高表达和时空特异性。与miRNA的海绵作用、蛋白翻译和调节RNA结合蛋白是circRNA的主要生物学功能。环状RNA的生物学功能在自身免疫性疾病中的研究报道较少。课题组前期研究发现,RA患者外周血单个核细胞中的hsa＿circ＿0088036表达升高,但hsa＿circ＿0088036在RA滑膜成纤维细胞的表达及功能尚未知。我们用生物信息学技术预测到hsa＿circ＿0088036有可能海绵吸附miR-140-3p,miR-140-3p的下游靶基因是SIRT1,而SIRT1对细胞增殖迁移有调控功能。为了确定hsa＿circ＿0088036/miR-140-3p/SIRT1轴在RA发病中的作用和机制,我们分三部分进行研究:（1）hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p和SIRT1在滑膜成纤维细胞中的表达;（2）体外实验探讨hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p对RA滑膜成纤维细胞增殖、迁移功能的调节作用;（3）hsa＿circ＿0088036/miR-140-3p/SIRT1调控滑膜成纤维细胞增殖、迁移的分子机制。第一章 hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p 和 SIRT1 在 RA 滑膜成纤维细胞中的表达目的:分离、纯化原代滑膜成纤维细胞,检测hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p和SIRT1在滑膜成纤维细胞中的表达水平。方法:1.取RA和OA患者的滑膜组织,先行机械分离,在细胞培养瓶中让细胞贴壁生长、传代,滑膜成纤维细胞可得到纯化;在显微镜下观察细胞形态,用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定细胞。2.用RT-PCR方法检测RA和OA滑膜成纤维细胞中的hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p和SIRT1的表达水平。结果:1.原代滑膜成纤维细胞呈梭形,核椭圆形。免疫荧光染色显示第4代的滑膜细胞98%以上vimentin染色阳性,流式细胞术显示93%的滑膜细胞vimentin染色阳性。2.与OA组相比,hsa＿circ＿0088036和SIRT1在RA组滑膜成纤维细胞中的表达水平升高,而miR-140-3p的表达在两组间无明显差异。结论:1.分离、纯化获得高纯度的人原代滑膜成纤维细胞。2.与OA相比,hsa＿circ＿0088036和SIRT1在RA滑膜成纤维细胞中表达异常升高,而miR-140-3p的表达无明显差异。第二章 hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p对RA滑膜成纤维细胞增殖、迁移功能的调节作用目的:通过体外实验明确hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p对RA滑膜成纤维细胞增殖、迁移的调节作用。方法:1.根据hsa＿circ＿0088036序列信息,进行质粒构建与腺病毒包装,分组为NC组和hsa＿circ＿0088036组,用包含hsa＿circ＿0088036质粒的腺病毒转染RA滑膜成纤维细胞,RT-PCR检测过表达效率。2.根据hsa＿circ＿0088036序列信息,设计3条siRNA靶点,用3条siRNA转染RA滑膜成纤维细胞,RT-PCR检测干扰效率,并挑选出干扰效率最高的siRNA。3.构建miR-140-3p的mimic和inhibitor,分别转染RA滑膜成纤维细胞,RT-PCR检测过表达和干扰效率。4.功能实验:过表达/干扰hsa＿circ＿0088036或者miR-140-3p,用EdU方法检测滑膜成纤维细胞的增殖功能,用transwell方法检测滑膜成纤维细胞的迁移功能。结果:1.用腺病毒感染的方法可有效过表达hsa circ＿0088036,用siRNA转染可有效干扰 hsa＿circ＿0088036 的表达。2.在RA滑膜成纤维细胞中,过表达hsa＿circ＿0088036,可促进细胞的增殖、迁移,干扰hsa＿circ＿0088036,可抑制细胞的增殖、迁移。3.mimic转染可有效过表达miR-140-3p,imhibitor转染可有效干扰miRNA-140-3p 的表达。4.在RA滑膜成纤维细胞中,过表达miR-140-3p,可抑制细胞的增殖、迁移,干扰miRNA-140-3p,可促进细胞的增殖、迁移。结论:hsa＿circ＿0088036能促进RA滑膜成纤维细胞增殖、迁移,miR-140-3p能抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖、迁移。第三章 hsa＿circ＿0088036通过吸附miR-140-3p影响SIRT1表达调控RA滑膜成纤维细胞增殖、迁移的机制研究目的:探索hsa＿circ＿0088036、miR-140-3p和SIRT1的相互作用机制。方法:1.生物信息学分析预测最有可能与hsa＿circ＿0088036存在结合位点的miRNA,过表达hsa＿circ＿0088036,筛出下调表达最明显的miRNA,并通过生物信息学预测miRNA的下游靶基因。2.在RA滑膜成纤维细胞中过表达/干扰hsa＿circ＿0088036,用RT-PCR检测miR-140-3p的表达变化,RT-PCR和Western blot检测SIRT1的表达变化。3.根据hsa＿circ＿0088036和miR-140-3p的结合位点信息,构建突变序列质粒,通过荧光素酶实验验证二者的靶向结合关系。根据miR-140-3p和SIRT1的结合位点信息,构建突变序列质粒,通过荧光素酶实验验证二者的靶向结合关系。4.挽救实验:在RA滑膜成纤维细胞中同时过表达hsa＿circ＿0088036和miR-140-3p,检测细胞的增殖与迁移功能的回复。结果:1.在 RA 滑膜成纤维细胞中过表达 hsa＿circ＿0088036,miR-140-3p,miR-873-5p,miR-611 andmiR-612的表达均降低,其中miR-140-3p降低最明显。2.过表达 hsa＿circ＿0088036 可引起 miR-140-3p 的 mRNA 水平下降,SIRT1 的mRNA和蛋白水平均升高;干扰hsa＿circ＿0088036可引起miR-140-3p的mRNA水平升高,SIRT1的mRNA和蛋白水平均降低。3.荧光素酶实验证实hsa＿circ＿0088036与miR-140-3p有相互作用,miR-140-3p与SIRT1有相互作用。4.挽救实验证实,同时过表达hsa＿circ＿0088036和miR-140-3p可逆转hsa＿circ＿0088036对滑膜成纤维细胞的增殖与迁移功能的促进作用。结论:1.hsa＿circ＿0088036与多种miRNA存在结合位点,过表达hsa＿circ＿0088036可导致miR-140-3p表达下调最明显,SIRT1的mRNA和蛋白水平均上调。2.hsa＿circ＿0088036 与 miR-140-3p 相互作用,miR-140-3p 与 SIRT1 相互作用,hsa＿circ＿0088036通过吸附miR-140-3p影响SIRT1表达调控RA滑膜成纤维细胞增殖、迁移。