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研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性对称性、多关节病变为主的自身免疫性、炎症性疾病,其发病机制不完全明确。主要病理基础是滑膜炎症和血管翳的形成。其中成纤维样滑膜细胞（fibroblsast-like synoviocyte,FLS）是RA的关键效应细胞。类风湿关节炎中的成纤维样滑膜细胞不仅凋亡减少、异常增生,在功能和行为上也出现异常,其具有较强的迁移和侵袭功能,并可释放可溶解软骨的基质组织蛋白酶（cathepsins）和金属蛋白酶（MMPs）,这些酶溶解软骨的胶原酶和基质后,其参与形成的血管翳可直接侵蚀到关节软骨和骨,造成骨质破坏。这些机制和作用是导致成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的病理生理学行为的基础,也是关节破坏的关键。氧化应激在RA中的作用逐渐引起研究者的关注,因为慢性炎症与氧化还原失衡关系密切,两者互为因果。晚期氧化蛋白产物（AOPPs）是一种新型的氧化应激生物标志物,既是氧化应激的产物,也可与受体RAGE结合后,进一步促炎促氧化。我们前期研究已证实RA患者血浆中AOPPs水平升高,并与RA的疾病活动度密切相关。基于以上理论及研究结果,我们主要围绕以AOPPs为代表的氧化应激物质对RA的主要效应细胞--成纤维样滑膜细胞的生物学功能及分泌功能的影响及机制,解析氧化应激在RA中的作用。研究方法我们主要进行体外细胞研究,使用不同浓度的AOPP-HSA（50-200μg/ml）处理RA-FLSs,观察其功能变化。第一部分,通过transwell小室观察AOPPs诱导的RA-FLSs细胞迁移、侵袭能力的变化。第二部分,AOPPs作用下,通过ELISA和QT-PCR方法检测TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13的分泌和mRNA表达水平。第三部分,通过Western blot和免疫荧光法检测NF-κB活化情况。结果第一部分AOPPs诱导的RA-FLSs细胞迁移、侵袭能力的变化一、AOPPs对FLS迁移能力的影响用AOPP-HSA（100μg/ml）处理RA-FLSs,与对照组、未修饰HSA组相比,48h后细胞迁移能力显著增强。（迁移细胞数:对照组,34.67±4.51;HSA组,32.67±2.06;AOPPs 组,71.677±2.52）。在阻断实验中,抗RAGE抗体可以减少AOPPs诱导的迁移。（迁移细胞数:AOPPs+抗 RAGE 抗体组,48.01±2.65）。二、AOPPs对FLS侵袭能力的影响用AOPP-HSA（100μg/ml）处理RA-FLSs,与对照组、未修饰HSA组相比,48h后细胞侵袭能力显著增强。（侵袭细胞数:对照组,22.33±4.16;HSA组,27.67±5.03;AOPPs 组,80.67±3.06）。在阻断实验中,抗RAGE抗体可以减弱AOPPs诱导的侵袭。（侵袭细胞数:AOPPs+抗 RAGE 抗体组,44.67±5.03）。第二部分 AOPPs 作用下 TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13 的分泌和 mRNA表达变化一、细胞上清中细胞因子IL-6、TNFα和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13浓度的测定RA-FLSs 与 0、50、100、200μg/ml AOPP-HSA 或 100dg/ml 未经修饰的 HSA共同孵育48小时后,细胞上清中炎症因子IL-6、TNFα和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13含量上调,呈剂量依赖性（p<0.05）。虽然200μg/ml AOPP-HSA组中 IL-6、TNFα MMP-3、MMP-13 的表达略低于 100μg/mlAOPP-HSA 组,但仍显著高于对照组。未经修饰的HSA与正常对照组相比,IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13的分泌无显著性差异（p>0.05）。RA-FLSs与 100μg/mlAOPP-HSA 或 100μg/ml未经修饰的HSA共同孵育0、6、12、24、48小时后,随着时间延长,细胞上清中炎症因子IL-6、TNFα和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13分泌量上调,呈时间依赖性（p<0.05）。未经修饰的HSA与正常对照组相比,IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13的分泌无显著差异（p>0.05）。在阻断实验中,抗RAGE抗体可以显著抑制AOPPs诱导的IL-6、TNFα,MMP-3、MMP-13 的分泌。二、RA-FLSs中细胞因子IL-6、TNFα和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13 mRNA表达的测定RA-FLSs 与 0、50、100、200μg/ml AOPP-HSA 或 100μg/ml 未经修饰的 HSA共同孵育48小时后,IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13 mRNA表达随刺激剂量的增加而升高,呈剂量依赖性（p<0.05）。虽然200μg/ml AOPP-HSA组中IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13 mRNA的表达略低于100μg/ml AOPPs组,但仍显著高于对照组。未经修饰的HSA与正常对照组相比,IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13 mRNA 的表达无显著性差异（p>0.05）。RA-FLSs与100μg/ml AOPP-HSA或100μg/ml未经修饰的HSA共同孵育0、6、12、24、48 小时后,随着时间延长,IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13 mRNA表达上调,呈时间依赖性（p<0.05）。未经修饰的HSA与正常对照组相比,IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13 的表达无显著性差异（p>0.05）。在阻断实验中,抗RAGE抗体可以显著抑制AOPPs诱导的IL-6、TNFα、MMP-3、MMP-13 mRNA 的表达。第三部分AOPPs对RA-FLSs的信号通路NF-κB的激活一、Western blot检测NF-κB亚基的变化RA-FLSs 分别与 0、50、100、200 μg/ml AOPP-HSA 或 100μg/ml 未经修饰的HSA共同孵育3小时后,NF-κB p65的磷酸化水平随着剂量增加而增加,IκBa蛋白呈剂量依赖性降低（p<0.05）。AOPPs的作用在100μg/ml时效果最大。未经修饰的HSA与正常对照组相比,p65的磷酸化和IκBα的减少无显著性差异（p>0.05）。RA-FLSs分别与100μg/ml AOPP-HSA或100μg/ml未经修饰的HSA共同孵育0、1、3及6h后,NF-κB p65的磷酸化水平随刺激时间的延长而升高,IκBa蛋白随时间延长进一步减少,呈时间依赖性（p<0.05）。在3小时时达到了最大的效果。未经修饰的HSA与正常对照组相比,p65的磷酸化和IκBα的减少无显著性差异（p>0.05）。在阻断实验中,抗RAGE抗体可有效抑制AOPPs诱导的NF-κB亚基的变化。二、免疫荧光法检测NF-κB p65亚基的核转移RA-FLSs分别与100μg/ml AOPP-HSA或100μg/ml未经修饰的HSA共同孵育3h后,免疫荧光染色显示p65进入细胞核;然而,在对照组和未修饰HSA的细胞中,p65仍停留在细胞质中。在阻断实验中,抗RAGE抗体可明显抑制AOPP诱导的NF-κB p65转移至核内。结论一、AOPPs可增加RA-FLSs的迁移能力,呈时间和剂量依赖性。二、AOPPs可增加RA-FLSs的侵袭能力,呈时间和剂量依赖性。三、AOPPs以时间和剂量依赖的方式上调RA-FLSs细胞因子IL-6、TNFα的表达。四、AOPPs以时间和剂量依赖的方式上调基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13的表达。五、AOPPs以时间和剂量依赖的方式通过激活NF-κB信号通路。六、AOPPs诱导的RA-FLSs的迁移侵袭和分泌功能的改变与RAGE受体的激活有关,阻断RAGE受体可显著抑制AOPP诱导的上述改变。七、抗RAGE抗体可显著阻断AOPPs激活的NF-κB信号通路。八、未经修饰的HSA对RA-FLSs无明显作用,证实了是由于蛋白氧化修饰对RA-FLSs产生的生物学效应。九、本研究证实,AOPPs通过与RAGE受体结合,激活NF-κB信号通路,诱导RA-FLSs的迁移侵袭功能改变和分泌功能增加。