一、研究背景肺癌是癌症相关死亡的主要原因,其中非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的形式,5年生存率不到20%。尽管目前在包括手术、放疗、化疗和靶向治疗等治疗方法方面取得了很大的进展,但由于大多数患者在诊断时已经达到晚期或广泛转移,预后仍然很差。其中,药物选择的局限性制约了肺癌的治疗。近年来,肺癌治疗的研究得到了更深一步的探索,其中纳米药物研究和免疫治疗研究受到了研究者们广泛的关注。部分研究结果的临床转换也为患者带来了福音,传统化疗药物所致的严重毒副作用不仅可通过纳米载体的运送明显减弱,还能借助于纳米载体本身的被动靶向作用将所携带的化疗药物富集在病变组织,更好的发挥治疗作用。不仅如此,相比于传统的化疗药物,纳米载体还能借助于其自身的物理特性（包括形状、尺寸、电荷、疏水性和化学成分）,精确调控药物在组织中的渗透性和药物释放效率。肿瘤抑制性免疫微环境作为一个越来越被关注的领域,在肿瘤治疗耐药的过程中发挥着关键的作用,为了解决这一难题,更多的研究工作开始专注于它们之间的联系。因此,本研究旨在探索同时携带有传统化疗药物-多西他赛和中草药提取物-姜黄素的新型纳米载体在肺癌中的协同抗肿瘤作用。二、研究方法1、材料的合成和表征通过化学方法依次合成纳米复合物胶束CMCS-BAPE（CB）,载单药纳米胶束 CMCS-BAPE-CUR（CB-C）、载单药纳米胶束 CMCS-BAPE-DTX（CB-D）、载双药纳米胶束CMCS-BAPE-DTX/CUR（CB-DC）和具有靶向的载双药纳米胶束T7-CMCS-BAPE-DTX/CUR（CBT-DC）。随后通过核磁氢谱（1HNMR）、红外光谱（FITR）、动态散射光（DLS）和投射电镜对对其进行表征,通过高效液相色谱仪（HPLC）和紫外光谱（UV-Vis）对多西他赛（DTX）和姜黄素（CUR）的体外释放行为进行评估。2、纳米药物体内外摄取及抗瘤效果的探索通过共聚焦和细胞流式观察纳米载体在肺癌细胞和体内移植瘤中的摄取程度;通过CCK-8和流式细胞术探索纳米药物在体外肺癌细胞的杀伤作用,并通过体内移植瘤进一步验证纳米药物的抗瘤效果。3、纳米药物在体内免疫调节作用的探索构建荷CMT-64肺癌的C57bl/6j小鼠,通过尾静脉注射药物,24小时后,获取小鼠皮下移植瘤并分成两份,一份用来固定做免疫组化（IHC）,随后包埋,切片,烤片、脱蜡、水化、封闭、孵一抗、孵二抗、DAB显色、苏木素复染等一系列操作检测肿瘤组织中的主要免疫细胞;另一部分通过流式细胞术检测肿瘤组织中免疫细胞的含量,通过制备单细胞悬液,封闭、孵表面蛋白一抗、通透、孵膜内蛋白一抗等一系列操作对肿瘤组织内的主要免疫细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg）进行标记并检测。三、结果4、纳米药物的成功合成和表征成功合成具有靶向作用的纳米药物（CBT-DC）,其粒径约为100-150nm。1H NMR结果显示化学位移3.90-4.20 ppm质子峰归属为羧甲基壳聚糖的O-CH2-C=O结构,化学位移6.89-7.76 ppm归属为苯硼酸频哪醇酯上苯环上和频哪醇酯上的质子峰,说明该疏水端成功实现与羧甲基壳聚糖的偶联作用。化学位移4.3-1.1 ppm之间有多个峰为T7肽的一系列质子峰,证明CMCS-BAPE-T7的成功合成。在红外光谱图中,与CMCS相比,CMCS-BAPE上3440-3300 cm-1处游离伯酰胺键、2900-2850 cm-1处烷烃主要特征峰、1650-1500 cm-1苯环骨架振动峰VC=C以及1250-1000 cm-1芳香氢面内弯曲振动峰β=C-H均有所加强,说明苯硼酸频哪醇酯与羧甲基壳聚糖通过酰胺键实现偶联。在纳米载体中,DTX和CUR的载药率分别为7.82%和6.48%。5、纳米药物优越的体内外摄取和抗瘤效果通过共聚焦显微镜和流式细胞仪观察到带有Cy5.5的CBT相对于Cy5.5的CB具有明显的细胞摄取能力,并在体内皮下移植瘤中进一步验证了 CBT较CB具有更好的肿瘤摄取能力。通过CCK-8和流式细胞凋亡术观察到CBT-DC相比于游离药物DTX、CUR和载单药纳米药物CB-D和无靶向能力的载双药纳米药物CB-DC具有更优越的抗瘤效果。在体内皮下移植瘤实验中,我们通过尾静脉注射药物后,CBT-DC能更加明显抑制肿瘤的生长,相对于游离单药DTX和CUR,载双药的纳米药物CB-DC也具有更好的抗瘤效果。6、载双药纳米药物CBT-DC改善肿瘤的免疫抑制性微环境在具备完整免疫系统的C57bl/6j小鼠中,按照既定的分组进行纳米药物的注射之后。首先,通过ELISA检测血液中的细胞因子IL-2和IL-10,观察到IL-2无明显变化,而IL-10在CBT-DC组则明显减少,与M2型巨噬细胞呈正相关的IL-10的减少说明CBT-DC能够有效减少它的含量,对抑制肿瘤免疫的不利因素能够得到有效的抑制。随后,在IHC和FCM对肿瘤组织中免疫细胞含量进行分析时,IHC结果显示NK细胞在CBT-DC组中明显升高,Treg细胞则是减少的;FCM结果与IHC略有不同的是,虽然CD4+和CD8+T细胞和Treg细胞无明显的变化,但是MDSC细胞明显减少,三者结果都表明CBT-DC能够减少免疫抑制性细胞的含量的同时,还能明显提高NK细胞的含量。四、讨论通过材料的合成及其验证和物理表征的鉴定,我们获得了一种新型的T7靶向的携带双药的纳米药物-CBT-DC。经过TEM和DLS检测确定CBT-DC为一种直径约为100-150nm的规则圆球形纳米颗粒,其中DTX和CUR的载药率分别达到了 7.82%和6.48%。在体内外的实验中均证实了纳米载体优越的肿瘤靶向功能,并验证了 CBT-DC优于游离单药的抗瘤效果。最后,更进一步探讨了 CBT-DC在肿瘤免疫抑制性微环境中的调节作用,证实其能通过抑制免疫抑制性微细胞Treg和MDSC的含量,并提高NK细胞的浸润达到改善肿瘤免疫微环境的效果。